Разделение белков путем адсорбции

Белки обладают способностью избирательно адсорбироваться на твердых фазах. Поэтому для разделения белков широко используются адсорбционные методы, особенно колоночная хроматография (рис. 1.2.4).

Применение этих методов позволяет получить наибольшую степень очистки белков. Важнейшими адсорбентами белков являются ионообменники. Белки связываются ионообменником с помощью электростатических сил между заряженными поверхностями белков и кластерами заряженных групп на ионообменнике. При разделении белков и их анализе используется жидкостная хроматография.

В жидкостной хроматографии зона разделяемых веществ с помощью тока элюирующей (вымывающей) жидкости перемещается относительно неподвижной фазы, которая обладает разным сродством к разделяемым компонентам.

Рис. 1.2.4. Схема колоночной адсорбционной хроматографии. Разделение двух разных веществ (А и В), перемещающихся по колонке с разной скоростью. 1 – нанесение образца на колонку; 2 – середина опыта; 3 – окончание опыта.

При перемещении зоны с помощью тока элюента каждый из разделяемых компонентов проводит некоторую часть времени на неподвижной фазе. Чем больше это время, тем медленнее перемещается зона с разделяемой смесью. Основной принцип хроматографического разделения приведен на рис. 1.2.5.

Рис. 1.2.5. Основной принцип хроматографического разделения: НФ – слой неподвижной фазы, покрывающей внутреннюю поверхность капиллярной трубки Т, через которую течет подвижная фаза (ПФ). Компонент А₁ разделяемой смеси обладает большим сродством к подвижной фазе, а компонент А₂ – к неподвижной фазе. А'₁ и А'₂ – положения зон тех же компонентов через промежуток времени, за которое происходило хроматографическое разделение в направлении, указанном стрелкой.

Выбор ионообменника

Выбор ионообменника определяется изоэлектрической точкой выделяемого белка. При значениях рН буфера ниже изоэлектрической точки белок имеет положительный заряд и адсорбируется на катионообменнике и,

наоборот. Обычно условия адсорбции выбирают эмпирически, так как чаще всего изоэлектрическая точка белка неизвестна, хотя ее можно определить путем изоэлектрического фокусирования. На рис. 1.2.6 представлено схематическое изображение частицы ионообменной смолы.

Рис. 1.2.6. Изображение структуры частицы ионообменной смолы. Черные кружки – заряженные функциональные группы, ковалентно связанные с нитями решетки; белые кружки – свободно перемещающиеся противоположно заряженные противоионы, электростатически связанные с частицей смолы, способные претерпевать обмен с другими ионами.