Получение гена, кодирующего фермент

Необходимый ген, кодирующий фермент может быть получен несколькими способами:

· химическим синтезом,

· синтезом методом ПЦР (полимеразной цепной реакции),

· выделением из геномной ДНК,

· синтезом с мРНК.

Синтезировать химическим путем удается относительно небольшие фрагменты ДНК, кодирующие небольшое число аминокислот. С разработкой и внедрением ПЦР этот метод стал все более активно использоваться и для синтеза генов.

Получение гена из геномной ДНК производится с использованием сайт-специфических эндонуклеаз рестрикции, называемых рестриктазами. Эти ферменты сыграли огромную роль в развитии генной инженерии. Рестриктазы разрезают двойную спираль по специфическим последовательностям из 4-8 нуклеотидов. Они могут вносить тупой или ступенчатый разрез.

Под действием рестриктаз, вызывающих ступенчатые разрывы, на обоих концах фрагмента ДНК образуются короткие одноцепочечные участки. Их называют “липкими концами”. Они способны к комплементарному взаимодействию с другим концом, образовавшимся под действием одного и того же фермента. Это используется для встраивания гена в вектор. Необходимо отметить, что способ получения гена из геномной ДНК, путем разрезания всей геномной ДНК с помощью рестриктаз приводит к тому, что клонируется огромное количество фрагментов. Это ведет к большому объему работы на этапе клонирования.

Ген может быть получен с помощью синтеза фрагмента ДНК с матричной РНК с использованием обратной транскриптазы. Такие фрагменты называют кДНК (комплементарными ДНК). Этот способ обладает следующими преимуществами: фракция мРНК, выделяемая из клеток представляет собой копии только активных – экспрессирующихся генов, в то время как геномная ДНК содержит большой объем неэкспрессируемых последовательностей. Кроме того, кДНК лишены интронов. Это может быть очень актуальным при клонировании эукариотических генов в прокариотических системах.