Изменение свойств ферментов генно-инженерными методами

Основным методом генно-инженерного изменении свойств ферментов является сайт-специфический мутагенез (или направленный мутагенез) – это целенаправленная нуклеотидная замена в клонированном гене, приводящая к замене одной аминокислоты на другую. Это позволяет исследовать роль определенных аминокислот в структуре фермента, а также получать ферменты с улучшенными свойствами.

Кроме аминокислотных замен в различных частях ферментов в настоящее все более развиваются генно-инженерные подходы по слиянию частей генов, кодирующих ферментов, что позволяет существенно модифицировать ферменты и даже создавать новые ферменты.

Методы сайт-специфического мутагенеза

С помощью компьютерного анализа на основании данных о структуре белка удается просчитать (предсказать) эффективную аминокислотную замену. Существует несколько методов сайт-специфического мутагенеза.

Сайт-специфический мутагенез с использованием рестрикции

Для произведения нужной аминокислотной замены из клонированного гена с использованием сайт-специфической эндонуклеазы вырезается небольшой фрагмент. Затем этот фрагмент заменяется на аналогичный искусственно-синтезированный с нужной нуклеотидной заменой, которая определит запланированную аминокислотную замену.

Этот способ не часто используется из-за сложности необходимости подбора рестриктазы, что не всегда удается.

Сайт-специфический олигонуклеотид-направленный мутагенез

В большинстве случаев сайт-специфического мутагенеза используется замена в праймере для ДНК-полимеразы. Варианты этого метода – это использование бактериофага М13 или использование ПЦР.

При использовании фага М13 интересующий ген клонируют в ДНК фага М13. Этот бактериофаг имеет одноцепочечную и двухцепочечную формы ДНК. Одноцепочечную форму этого фага копируют с использованием олигонуклеотидного праймера синтезированного таким образом, чтобы в гене-мишени была замена одного нуклеотида. Олигонуклеотид в точности комплементарен последовательности за исключением одного нуклеотида в нужном сайте. Неспаренный нуклеотид обычно должен находиться примерно посередине олигонуклеотида. 3'-конец нуклеотида служит затравкой для синтеза ДНК. Затем двухцепочечными ДНК М13 трансформируют клетки E.coli. В клетках фаг реплицируются и одна часть рекомбинантных фаговых частиц будут содержать необходимую замену, другая часть останется дикого типа.

Сходным образом олигонуклеотид-направленный мутагенез может осуществляться с помощью плазмидной ДНК.