Вставка гена в вектор

Ген вводится в специальные молекулы ДНК, которые обеспечивают функционирование гена в новой генно-инженерной системе. Генетические элементы, используемые для создания рекомбинантной ДНК и введения ее в клетку, называют векторами. В качестве векторов чаще всего используют вирусы и плазмиды.

Плазмидные векторы созданы на основе природных бактериальных плазмид. Они представляют собой небольшие кольцевые молекулы двухцепочечной ДНК. Такие векторы способны автономно реплицироваться благодаря наличию точки инициации репликации (ori). Плазмиды, которые используются в генной инженерии, содержат селективные маркеры. В качестве селективных маркеров часто используются гены устойчивости к антибиотикам. Обычно векторная молекула несет более одного селективного маркера. Благодаря таким маркерным генам на последующих этапах клетки, несущие рекомбинантную плазмиду, легко отделить от клеток, не имеющих такой рекДНК.

Вставка гена в вектор, т.е. создание рекДНК осуществляется стандартно с использованием рестриктаз. Векторная молекула, кроме ori и селективных маркеров должна нести уникальные сайты рестрикции для нескольких рестриктаз. Уникальный сайт рестрикции обеспечивает то, что при обработке соответствующей рестриктазой кольцевая молекула будет разрезана в одном строго определенном месте и превратится в линейную. При соединении клонируемого гена и вектора, обработанных одной и той же рестриктазой, эти молекулы могут соединяться в одно целое путем спаривания оснований «липких концов». Полученная молекула ДНК (вектор со встроенным геном) называется рекомбинантной (рекДНК). Соответственно, кодируемые рекомбинантными ДНК ферменты называют рекомбинантными ферментами, а клетки, экспрессирующие такие ферменты (или другие белки) – рекомбинантными клетками или рекомбинантными системами.

Трансформация клеток рекомбинантными ДНК

Рекомбинантные кольцевые молекулы ДНК вводят в клетки (обычно бактериальные или дрожжевые), то есть трансформируют плазмидами. Для этого их делают временно проницаемыми для ДНК. Для повышения проницаемости клеток их обрабатывают ионами Ca²⁺ на холоду или обрабатывают электрическим током (процедура носит название электропорации). Если используется рекДНК, созданная на основе вирусного вектора, то процедура введения рекДНК в клетки носит название трансфекции.

После трансформации/трансфекции клеткам предоставляются оптимальные условия для размножения. Далее клетки высевают на плотную питательную среду для того, чтобы каждая клетка дала клон.

Отбор клонов

Все клетки одного клона генетически однородны и могут быть нескольких вариантов:

· не содержать рекДНК,

· содержать вектор без вставки гена;

· содержать рекДНК.

Для того, чтобы выявить клоны, содержащие рекДНК используется отбор на основе селективных маркеров. Так, когда в качестве селективных маркеров используется гены устойчивости к антибиотикам, клетки высевают на селективную питательную среду, содержащую соответствующий антибиотик. В таком случае расти будут только те клетки, которые имеют вектор с геном устойчивости. Чтобы выявить клетки, несущие не просто вектор, а рекДНК, используется отбор на основании второго маркера.

В случае клонирования фрагментов, полученных из геномной ДНК или кДНК получают набор клонов, несущих рекДНК с различными вставками – библиотеки геномной и кДНК. Для отбора клона с нужным геном из библиотеки используется гибридицация нуклеиновых кислот или анализ с помощью антител к белковому продукту клонированного гена.