От традиционной клинической диагностики к персонализированной диагностике на основе постгеномных технологий

В современной медицине клиническая диагностика, в частности инструментальная, как, например, различные виды томографии, является существенно более персонализированной и направленной на контакт клинициста с каждым конкретным пациентом, чем лабораторные методы исследования. Обычно лабораторные тесты рассматривают одну или несколько групп, очень разнородных клинически, и вводят жесткие критерии «отсечения» для того или иного биомаркера. Примером может послужить тест на простат-специфический антиген (PSA) при раке предстательной железы. Этот белок часто достигает принятого для рака простаты критического уровня при воспалительных и доброкачественных состояниях простаты, и из-за этого в ряде стран не так давно перестал быть рекомендованным для широкого скрининга [29].

Для перехода лабораторной диагностики заболеваний в русло персонализированной медицины перспективным инструментом могут стать постгеномные технологии, инвентаризирующие в организме человека результаты генной экспрессии на разной стадии: матричные и другие РНК (транскриптомика), белки (протеомика) и, наконец, метаболиты (метаболомика).

Для диагностики и мониторинга лечения ряда заболеваний предложены подходы транскриптомики, т.е. инвентаризации РНК с помощью технологий микрочипов [3] и высокопроизводительного секвенирования нуклеиновых кислот [25, 30]. Это позволяет, например, дифференцировать отдельные виды рака и их подтипы, требующие разных схем терапии [25, 30]. Имеются сообщения о применении подходов транскриптомики к ряду других заболеваний: сердечно-сосудистых, ревматических, неврологических и др. [3]. Информативным, в частности, считают оценку микроРНК (миРНК), содержащей обычно 22 нуклеотида и способной ингибировать генную экспрессию через влияние на тРНК [31]. Так, некоторые различия миPHK клеток печени оказались сопряженными с влиянием на эффективность репликации вируса гепатита С [32].

Интенсивно развивающимся подходом персонализированной медицины является использование протеомики. Для поиска критериев разграничения между состоянием здоровья и болезнью протеомика должна определить полный набор белков, ассоциированных с конкретным физиологическим или патологическим состоянием. Именно протеомику рассматривают как приоритетную область для выявления биомаркеров [3]. Применение протеомики для выяснения действия лекарственных средств, включая индивидуальные особенности пациентов, определяют термином «фармакопротеомика». Растущий интерес к протеомике объясняют тем, что информация о последовательностях ДНК дает только статичный моментальный снимок различных путей, которые может использовать клетка, в то время как жизнь клетки представляет собой динамический процесс, в более полной степени отражаемый ее белковым набором [34].

Методы, используемые в протеомике, в т.ч. клинической, интенсивно развиваются [35]. Все подобные исследования находятся в соответствии с начатой в сентябре 2010 г. работой по проекту «Протеом человека» (Нuman Proteome Project, НРР) [34, 36], согласно которому планируется создание протеомной карты, включающей все белки, кодируемые геномом человека. Первоочередные задачи проекта: составление протеомных карт основных, или «мастерных», белков плазмы крови, печени, головного мозга. Для целей персонализированной медицины в этом плане возлагаются большие надежды на получение данных, связанных с протеомом крови, с учетом индивидуальных изменений в норме и при развитии патологии.

Наряду с выявлением белковых маркеров в плазме крови предполагается возможность осуществления персонализированной клинической диагностики на основании общего белкового профиля. Для этого предполагают проведение масс-спектрометрической характеристики образцов крови без идентификации индивидуальных белков («протеомный штрих-код») [37], что дало многообещающие предварительные результаты при ряде злокачественных опухолей [38].

Среди протеомных методов, перспективных для персонализированной медицины, следует отметить белковые биочипы, на которых иммобилизованы связывающие белки — антигены, антитела, ферменты [33], масс-спектрометрическую визуализацию тканей человека, или имиджинг [35, 39], и некоторые др. [40]. На сегодняшний день практическое использование протеомики для персонализированной медицины считают в большей степени делом будущего, возможно, ближайших нескольких лет [3, 33].

Определение низкомолекулярных продуктов различного происхождения определяют как отдельную область персонализированной медицины в диагностике — метаболомику. Метаболом человека содержит более 5000 низкомолекулярных метаболитов. Некоторые из них могут быть индикаторами патологических состояний. Их детектируют преимущественно с помощью масс спектрометрии и иногда путем ядерно-магнитного резонанса [49]. Метаболические маркеры значительно лучше, чем белки, подлежат оценке путем количественной масс-спектрометрии. Установлен ряд изменений метаболома при ишемии, диабете, нейродегенеративных болезнях [3], злокачественных опухолях, в частности при раке предстательной железы [50, 51].

В связи с переходом от больших групп пациентов к более раздробленным по различным критериям, а в идеале — к персонализированному подходу, большое значение приобретают биобанки (криобанки биологического материала) [52, 53]. Особый интерес представляют научные программы, где в биобанк депонируются образцы доступных биологических жидкостей от одного индивида в разные периоды его жизни [54]. В таком случае имеется уникальная возможность использовать для диагностики в качестве контроля собственный биологический материал, полученный ранее. Таким образом, будут сняты проблемы наблюдаемых у людей межиндивидуальных колебаний уровня биомаркеров и других белков плазмы крови или мочи [55]. В настоящее время создание биобанков в сочетании с регистрами пациентов рассматривается как основной путь к проведению трансляционных исследований по внедрению фундаментальных знаний в практическую медицину [53].

Медицинская диагностика — это набор правил, методов и решений, которые позволяют прийти к заключению о наличии или вероятности наличия у человека того или иного заболевания. Сегодня открытие новых и совершенствование уже существующих методов диагностики является важным направлением медицинских исследований. Так, одной из самых сложных задач, которую пытается решить человечество, является противодействие онкологическим заболеваниям, и все революционные методы терапии в онкологии появились главным образом из-за развития методов диагностики рака на ранней стадии. Но проблема слишком поздней диагностики болезней до сих пор остается решающей для лечения. В то же время ранняя диагностика таких заболеваний, как диабет или болезни сердца, позволяет разработать эффективные методы их профилактики. Раннее диагностирование не всегда равно излечению, но развитие методов поиска биомаркеров и признаков заболеваний буквально ежедневно стимулирует биомедицинские исследования и продвигает нас в поиске лекарства от рака или болезни Альцгеймера.

Как выявить заболевания сердца на ранней стадии? Наночастицы в нашем организме, которые переносят информацию о болезнях.

Наночастицы экзосомы в организме несут информацию о состоянии клетки, и в том числе о болезнях. Эти пузырьки получили название «экзосомы». Экзосомы - это внеклеточные везикулы, диаметр которых 35—90 нанометров, выделяются в межклеточное пространство клетками различных тканей и органов. Также они обнаружены в тканевых жидкостях организма: в сыворотке крови, моче, спинномозговой жидкости и слюне. Их полость имеет цитоплазму и в себя включает различные виды белков, микроРНК и липиды.

Необходимым условием жизнедеятельности многоклеточного организма являются межклеточные взаимосвязи, позволяющие скоординировать биохимические процессы, протекающие в его клетках. Такая коммуникация даёт возможность контролировать и направлять развитие и работу организма. Например, развитие эмбриона требует сложнейшей регуляции: необходимо, чтобы все клетки правильно посылали сигналы о себе и правильно реагировали на сигналы, полученные извне. Неадекватная реакция на такой сигнал может привести к аномалиям развития или к таким заболеваниям как рак. Сигналы передаются с помощью гормонов, цитокинов и хемокинов, факторов роста, нейромедиаторов, метаболитов, ионов и проч. Передача сигналов может осуществляться как путем секреции во внеклеточное пространство, так и через щелевые контакты напрямую между клетками [1]. Однако эти способы передачи сигнала предполагают либо тесный контакт между клетками, либо слишком просты для того, чтобы обмениваться комплексной информацией на расстоянии.

Как недавно выяснилось, есть еще один способ передачи информации между клетками — крошечные внеклеточные пузырьки, выделяемые клетками в окружающую среду и разносимые кровотоком по всему организму [2]. С момента открытия и до начала XXI века никто ими особенно не интересовался. Потом выяснилось, что они обладают способностью регулировать иммунные реакции организма. Когда же в 2007 году в них были обнаружены нуклеиновые кислоты, стало ясно, что это пока недостаточно изученный механизм координации и «взаимопомощи» клеток организма [3].

Благодаря тому, что эти пузырьки несут белки, липиды и нуклеиновые кислоты, они способны воздействовать на клетку-адресата гораздо более сложным способом, чем отдельные растворенные вещества. Дополнительное удобство здесь в том, что содержимое пузырька окружено мембраной, которая предохраняет его от воздействия среды. Рецепторы на поверхности мембраны обеспечивают доставку точно по адресу. Путешествуют такие «посылки» наиболее экономичным «водным транспортом» — с жидкостью, циркулирующей по кровеносным и лимфатическим сосудам. Таким образом обеспечивается обмен информацией между удаленными клетками в самых разных органах и частях тела.

Помимо переноса информации внеклеточные везикулы могут участвовать и в механизмах «взаимопомощи» — доставлять готовые белки, необходимые «адресату». Например, внеклеточные пузырьки, называемые экзосомами, переправляют от нейронов к мышечным клеткам мембранный белок синаптотагмин-4. Он нужен для формирования нервно-мышечного соединения (синапса), через которое передаются электрические сигналы от нейронов к мышечным клеткам. Производится этот белок в нервных клетках, а используется в мышечных, так что без пересылки тут не обойтись [4].

В 2013 году работы по изучению везикулярного транспорта были удостоены Нобелевской премии: «Нобелевская премия по физиологии и медицине (2013): везикулярный транспорт» [5].

В зависимости от того, как образуются внеклеточные пузырьки и какой они величины, их называют апоптозными тельцами, эктосомами или экзосомами.

Апоптозные тельца, они же апотельца, — это ограниченные плазматической мембраной фрагменты клетки, образующиеся в результате апоптоза — регулируемой организмом самоликвидации клетки. Они имеют размер около 50–5000 нм в диаметре и могут содержать органеллы или даже фрагменты ядра погибшей клетки.

Эктосомы, или почкующиеся микровезикулы, образуются путем выпячивания плазматической мембраны из клетки наружу; выпуклость отшнуровывается от мембраны клетки и превращается в пузырек. Это довольно крупные пузырьки — обычно от 50 до 200 нм, но иногда достигают и 1000 нм в диаметре.

Экзосомы — небольшие пузырьки (обычно от 40 до 100 нм). Первоначально они образуются внутри клетки — почкуются в полость, называемую эндосомой. Когда в этой полости накапливается достаточно много экзосом, дальнейшая ее судьба зависит от того, какими липидами промаркирована ее мембрана. Если эндосома помечена лизобисфосфатидиловой кислотой (фосфатидилинозитол-3-фосфат) и содержит убиквитинированные белки, то ее содержимое будет уничтожено: она сольется с лизосомой — мембранным пузырьком, наполненным ферментами, которые расщепляют белки, углеводы, липиды и нуклеиновые кислоты. Если же мембрана эндосомы содержит церамиды — это сигнал «отправить почту»: эндосома сливается с поверхностной мембраной клетки, и множество экзосом выталкивается наружу, во внеклеточную среду.

Экзосомы и эктосомы были обнаружены в самых разных полостных жидкостях организма: их можно найти в моче, в сперме, в сыворотке крови, в лимфе, в слюне, в слезах, в выделениях из носа, в желчи, в околоплодных водах и даже в грудном молоке. Производить экзосомы, как теперь известно, способна почти любая наша клетка — от желудочно-кишечного тракта и желез внутренней секреции до кожи и мозга.

Как выделить нужные экзосомы? Это придумал сам организм. Организм вырабатывает антитела на любой антиген. Например, когда в организм попадают вирусы, он начинает вырабатывать антитела. Ученые научились вырабатывать антитела в искусственных условиях, и регистрировать нужные клетки. В случаях заболеваний сердца есть два вида частиц. Когда сердце начинает испытывать недостаточность, в крови увеличиваются апоптозные клетки – клетки, возникающие в результате распада сердечной мышцы. Организм начинает тут же организовывать клетки, которые способствуют заживлению: сердечная мышца должна расти быстро. У больного человека резко меняется соотношение и количество этих клеток. И, меряя соотношение этих клеток, можно диагностировать заболевания сердца на ранней стадии.

Посмотреть видео.

Вопрос для семинара: Предмет и задачи тераностики.