Работа 48. Сравнительное изучение активности сукцинатдегидрогеназы в различных тканях крыс и ее конкурентное торможение

РАЗДЕЛ 3. БИОЭНЕРГЕТИКА

Контрольные вопросы

1. Какими свойствами гликогена можно объяснить реакции осаждения?

2. Какой принцип положен в основу метода определения уровня глюкозы в крови?

3. Два пациента сдали кровь для определения в ней глюкозы. Одни пациент пришел строго натощак, другой – спустя 1,5 часа после приема пищи. У кого из пациентов получены достоверные результаты?

4. У новорожденного обнаружили гипогликемию, повышенное содержание пирувата и лактата в крови. В интервалах между кормлениями у ребенка возникали судороги, однако на короткое время состояние больного резко улучшалось. Эти данные позволили предположить у ребенка наличие наследственного нарушения обмена гликогена. Используя имеющуюся информацию, назовите фермент, дефект которого вызывает такую клиническую картину болезни.

Обмен энергии в организме тесно связан с обменом веществ. Аэробные организмы, к которым относятся млекопитающие, получают большую часть энергии за счет биологического окисления, при котором во время катаболизма электроны переносятся от органических молекул на молекулу кислорода. Этот перенос осуществляется дыхательной цепью (электрон-транспортной цепью - ЭТЦ), состоящей из белковых комплексов, находящихся во внутренней мембране митохондрий и содержащих реакционные центры. Более половины свободной энергии электронов расходуется на синтез АТР. АТР служит источником энергии для протекания большого количества химических реакций. Основными субстратами (донорами электронов) для митохондриальной дыхательной цепи являются компоненты общего пути катаболизма (пируват, изоцитрат, малат, сукцинат, α-кетоглутарат). В этот путь включаются все метаболиты белкового, углеводного и липидного обмена.

Сукцинатдегидрогеназа является железофлавопротеином и прочно связана с клеточной структурой.

Принцип метода. Для определения активности фермента в качестве окисляемого субстрата берут янтарную кислоту, а в качестве акцептора водорода – краситель 2,6-дихлорфенолиндофенол (синего цвета), который, восстанавливаясь, превращается в бесцветную лейкоформу. Источником фермента служат гомогенаты мышц, мозга, печени, почек крысы. Сукцинатдегидрогеназная активность тормозится в присутствии малоновой кислоты (НООС-СН₂-СООН), являющейся структурным аналогом янтарной кислоты.

Исследуемый материал: скелетные мышцы, мозг, печень, почки, сердце крысы.

Реактивы: 1%-ный растворянтарной кислоты, 1%-ный раствор малоновой кислоты, 10%-ный раствор NaOH, 0,1%-ный раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола, дистиллированная вода.

Оборудование: пробирки, пипетки, воронки, стеклянные палочки, ступки, марлевые фильтры, пинцет, кипящая водяная баня, ножницы.

ХОД РАБОТЫ. Для получения ферментативного препарата1 г свежей ткани, измельченной ножницами, растирают в ступке с небольшим количеством воды. Затем кашицу переносят на двойной слой марли, помещенной на воронку, и промывают 50 мл дистиллированной воды. Промытую кашицу отжимают, переносят в пробирку и суспендируют стеклянной палочкой в 4 мл воды. Полученную суспензию равномерно разливают в 4 пробирки.

Содержимое 1-й пробирки кипятят в течение 1-2 мин для инактивации фермента. Затем в пробирки наливают реактивы по схеме, приведенной в таблице.

№ пробы	Сукцинат, мл	Н2О, мл	Малонат, мл	Краситель, мл	Окраска	Вывод
		0,5	-	2 капли
		0,5	-	2 капли
	-	1,5	-	2 капли
		-	0,5	2 капли

Через 15 мин наблюдают окраску раствора в пробирках. Делают вывод.

Работа 49. Количественное определение макроэргических соединений в мышцах (АТР и креатинфосфата)

В мышечной ткани содержится два макроэргических соединения – АТР и креатинфосфат, которые обеспечивают по мере надобности мышцу большим количеством энергии.

Основной путь образования АТР в тканях – окислительное фосфорилирование в процессе тканевого дыхания. Креатинфосфат образуется в мышце при участии АТР в состоянии покоя и служит резервом высокоэргического фосфата для синтеза АТР из ADP при активной мышечной работе.

Принцип метода. Метод определения макроэргических соединений в мышцах основан на том, что два последних остатка фосфорной кислоты в АТР, богатые энергией, так же как и фосфатный остаток в креатинфосфате, легко отщепляются при непродолжительном гидролизе в кислой среде (так называемый лабильно связанный фосфор). Сравнение содержания неорганического фосфора в пробах до и после гидролиза дает представление о количестве лабильно связанного фосфора, которое приходится на долю макроэргических соединений мышечной ткани. Количество фосфора определяют по цветной реакции с молибдатом аммония в присутствии аскорбиновой кислоты.

Исследуемый материал: скелетные мышцы крысы.

Реактивы: 2,5%-ный раствор ТХУ, 1 М раствор НСl, 1 М раствор NaОН, 1%-ный раствор молибдата аммония, 1%-ный раствор аскорбиновой кислоты.

Оборудование: пробирки, пипетки, воронки, фильтры, мерная пробирка или цилиндр объемом 10 мл, ледяная и кипящая водяная бани, ФЭК, кюветы с длиной оптического пути 10 мм.

ХОД РАБОТЫ. Мышечную кашицу в количестве 0,5 г помещают в пробирку, стоящую на ледяной бане, и добавляют в нее 5 мл охлажденного раствора ТХУ. Содержимое пробирки перемешивают стеклянной палочкой для экстрагирования АТР и креатинфосфата в течение 5 мин. Экстракт фильтруют в мерную пробирку, стоящую на ледяной бане.

Остаток мышечной кашицы в пробирке заливают 5 мл дистиллированной воды и продолжают экстракцию 5 мин на холоде. Полученный экстракт фильтруют в ту же мерную пробирку и доводят общий объем до 10 мл дистиллированной водой.

В 2 пробирки – контрольную и опытную – наливают по 0,5 мл безбелкового фильтрата. В опытную пробирку добавляют 1 мл 1 моль/л НСl, закрывают фольгой и помещают на кипящую водяную баню на 10 мин для гидролиза фосфорных связей. Затем раствор охлаждают и добавляют 1 мл 1 моль/л NaOH.

В контрольную пробирку (без предварительного кипячения) добавляют 1 мл 1 моль/л раствора НСl и 1 мл 1 моль/л NaOH. Затем в обе пробирки добавляют по 7,5 мл дистиллированной воды до получения объема 10 мл.

Дальнейшие процедуры проводят обязательно одновременно. Из обеих пробирок отливают по 5 мл жидкости, переносят в 2 другие пробирки и добавляют в каждую из них по 0,5 мл молибдата аммония, 0,5 мл аскорбиновой кислоты и 2 мл дистиллированной воды. Смесь в каждой пробирке быстро перемешивают и оставляют стоять при комнатной температуре точно 10 мин.

Контрольную и опытную пробы колориметрируют на ФЭКе с красным светофильтром (длина волны 670 нм) в кюветах с толщиной слоя 1,0 см против воды. В опытной пробе (после гидролиза) определяемый неорганический фосфат представляет собой сумму лабильно связанного фосфора и солей фосфата, присутствующих в тканях. В контрольной пробе определяются только фосфатные соли.

Вычитают из оптической плотности, найденной для опытной пробы, оптическую плотность, полученную для контрольной пробы. Концентрацию лабильно связанного неорганического фосфата в пробе находят по калибровочному графику. Для построения калибровочного графика используют концентрации неорганического фосфата от 200 мкг до 20 мкг в пробе.

Рассчитывают количество лабильно связанного фосфора в миллиграммах на 100 г сырой массы, учитывая разведение:

х = А (3,3• 400) •100,

где х – содержание макроэргических соединений в пересчете на 1 мг АТР в 100 г сырой ткани, мг/100 г; А – содержание АТР в пробе, мг; 3,3·400 - коэффициент пересчета на 1 г ткани с учетом разведения растворов.

Принцип метода и полученные результаты записывают в тетрадь.