Приготовление и стерилизация питательных сред

Одним из важных этапов микробного биосинтеза является приготовление питательных сред. Отделение приготовления питательной среды на современном биотехнологическом производстве – это цех, оборудованный емкостями для хранения твердых и жидких веществ, средствами их транспортировки и аппаратами с перемешивающими устройствами для приготовления растворов, суспензий или эмульсий.

Для приготовления производственной питательной среды предварительно растворяют сахара и соли, тщательно суспендируют такие нерастворимые компоненты, как соевая мука и мел. Крахмалосодержащее сырье предварительно клейстеризуют. Для ускорения эти процессы проводят в небольших аппаратах с мешалками (реакторах), а затем растворы смешивают в смесителе-реакторе с плоским дном, снабженным барботажным устройством для ввода пара. Концентрат среды, составляющий около одной трети необходимого объема, для окончательного растворения и суспендирования нагревают острым паром до 70-80 ºС. При этой температуре не происходит разложения термолабильных компонентов среды. Приготовление более концентрированных сред дает возможность использования смесителей меньшей вместимости.

Необходимое условие успешной стерилизации питательной среды – тщательная гомогенизация ее твердых компонентов. При температуре стерилизации крупные частицы медленно прогреваются, и в них может сохраняться постоянная микрофлора, способная инфицировать культуральную жидкость.

Для приготовления питательных сред в биотехнологическом производстве используют мелассу (побочный продукт сахарных заводов), ацетоно-бутиловую барду (отходы производства ацетона и бутанола), сыворотки (побочный продукт молочной промышленности), гидролизаты древесины, сульфитный щелок (отходы целлюлозно-бумажной промышленности). Ацетоно-бутиловая барда содержит около 1% углеводов, используется для получения витамина В₁₂ микробиологическим путем.

Щепа, опилки, сельскохозяйственные отходы, малоразложившийся торф и их гидролизаты используются в производстве кормовых дрожжей, этанола. Они содержат 2,5-8,0% моносахаридов (после гидролиза), кукурузная мука – 67-70%. Уксусная кислота применяется для приготовления питательных сред в производстве лизина. Метиловый спирт получают каталитическим синтезом из оксидов углерода и водорода. Это источник углеродсодержащего сырья для производства микробного, кормового и пищевого белка.

Питательная среда перед подачей в ферментер должна быть обеззаражена. На этом этапе подготовки субстрата необходимо решить две задачи: полностью уничтожить всю контаминантную микрофлору, которая содержится в необходимом для культивирования объеме жидкости, и сохранить биологическую полноценность питательной среды.

Существуют следующие методы стерилизации оборудования, питательных сред и воздуха: термический, химический, фильтрационный, радиационный. Термический метод чаще всего применяется для стерилизации оборудования и питательных сред и может осуществляться как нагревание объекта до того, пока не погибнет вся микропопуляция.

Жидкую питательную среду после загрузки в ферментер нагревают до определенной температуры путем подачи пара во внутренний объем ферментера. Этим приемом достигается стерилизация труб и арматуры.

Тепловая стерилизация приводит к определенным химическим изменениям в составе питательной среды. Некоторые из них сводятся к разложению нестойких к нагреванию соединений, что приводит к потере необходимых для питания микроорганизма веществ. В процессе стерилизации может происходить взаимодействие различных компонентов среды и образование продуктов, ингибирующих рост микроорганизмов. большинство изменений химических ингредиентов среды возникает при температурах выше, чем температура стерилизации.

Следовательно, эффективная стерилизация в сочетании с минимальными изменениями среды может быть достигнута путем воздействия более высокой температуры, а также быстрого нагревания и охлаждения.

Если стерилизацию углеводов проводить отдельно, а затем асептически добавлять к остальной заранее простерилизованной питательной среде, то можно предотвратить реакции между углеводами и другими составными компонентами среды. Те компоненты, которые в высшей степени чувствительны к воздействию тепла, также могут быть простерилизованы раздельно. При этом для стерилизации может применяться ионизирующее облучение или фильтрация через специальные мембранные фильтры.

Для обеспечения контроля стерилизации используют споры тест микроорганизмов Bacillus stearothermophilus штамма 1518. Если после проведения стерилизации из ампулы с тест-культурой высев дает отрицательный результат, считают, что произошло уничтожение всех микроорганизмов, контаминировавших среду.

Решая задачу по гарантированной стерильности питательной среды, следует помнить, что режим обеззараживания не должен снижать ее биологическую полноценность. Если в состав стерилизуемой фазы входят термолабильные компоненты, то следует стремиться к повышенной температуре (более 140ºС), а также к сокращению времени обработки. Лабильность компонентов может быть изменена за счет сдвига pH стерилизуемой среды. Например, для глюкозы оптимальными являются pH=3,0, а для сахарозы – pH=8,0.

Термический способ стерилизации применяется наиболее часто в микробиологической промышленности. Однако для стерилизации твердых питательных сред применяют токи высокой частоты. Стерилизация осуществляется в течение нескольких минут, при этом физико-химические свойства компонентов среды не изменяются.

Химический способ стерилизации – это применение дезинфицирующих агентов – β-пропионатов, окись этилена, окись пропилена. Основной проблемой в этом случае оказывается необходимость устранения стерилизующего агента из питательной среды после гибели посторонней микрофлоры. Поэтому химические антисептики должны легко разлагаться при изменении условий после завершения стерилизации. Выбор таких соединений невелик, и пока их нельзя считать легко доступными. К числу лучших из них можно отнести пропиолактон, обладающий сильным бактерицидным действием и легко гидролизуемый в нетоксичную молочную кислоту. Химическая стерилизация питательных сред не нашла промышленного применения, однако используют ее в лабораторных и опытных установках.

Фильтрационный метод стерилизации применяют для воздуха и газов, подводимых к реакторам. Из фильтров различных типов наиболее перспективны мембранные фильтры из тефлона.

Метод основан на способности полупроницаемых мембран (типа микрофильтрационных) пропускать жидкую фазу и задерживать клетки микроорганизмов.

Метод стерилизующей фильтрации является идеальным средством стерилизации термически неустойчивых жидких и газовых сред. Стерилизация осуществляется при низкой температуре и требует лишь градиента давления по разные стороны мембраны. Мембранная стерилизация имеет перспективы в развитии микробной биотехнологии. Основная трудность – наличие термостойких мембран, способных выносить многократную термическую стерилизацию их в процессе эксплуатации. Можно утверждать, что по мере создания совершенных конструкций мембранных аппаратов для стерилизации, рассчитанных на длительную эксплуатацию, данный метод будет широко применяться в крупнотоннажных производствах.

Подготовленное и соответствующим образом поданное в техногенную экологическую нишу сырье должно быть использовано биообъектом в процессе культивирования. Этап культивирования слагается из получения посевного материала (инокулята) и из стадии биосинтеза (биотрансформации), когда в максимальной степени используются возможности биообъекта для наработки целевых продуктов.

ПОЛУЧЕНИЕ ПОСЕВНОГО МАТЕРИАЛА

Для получения посевного материала используют исходную музейную культуру продуцента, которая поступает в заводскую лабораторию из научно-исследовательского института или с посевной станции.

Как правило, посевной материал, содержащий молодые, растущие клетки микроорганизмов на начальной стадии спорообразования (споры, конидии) поступает в пробирках на скошенных агаровых средах или в виде чистых культур в ампулах.

Каждая производственная культура имеет паспорт, в котором указаны продуцент и его коллекционный номер, серия и дата изготовления, средняя активность серии и срок годности. В паспорте представлена характеристика среды для выращивания и хранения культуры. Полученный посевной материал подвергают тщательному микробиологическому и биохимическому контролю, так как от его активности и чистоты зависит дальнейший производственный цикл.

В зависимости от вида продуцента, его физиолого-биохимических способностей приготовление посевного материала (до стадии производственной ферментации) проходит в несколько этапов:

1. Исходная культура.

2. Скошенная агаровая среда.

3. Выращивание на качалке в колбах на жидкой питательной среде (одна или две стадии).

4. Посевные аппараты (одна, несколько стадий).

5. Стадия производственной ферментации.

Исходную культуру при оптимальных температурах выращивают в пробирках на скошенной агаровой питательной среде. Для микроскопических грибов, актиномицетов продуценты культивируют до наступления оптимального спорообразования (72-120 час), для бактериальных культур фаза устанавливается эксприментально.

Выращенную культуру (1-5% от объема) с поверхности скошенной агаровой среды стерильно смывают водой и переносят в колбы Эрленмейера на 750 мл, содержащие 50-100 мл жидкой питательной среды. Засеянные колбы выращивают на качалке (120-240 об/мин) при температуре 28-30-50°С в течение 18-36 часов, т.е. глубинным способом, что увеличивает скорость роста культуры. Все стадии роста продуцента контролируют по морфологическим показателям микроорганизмов. При этом установлено, что наилучшие результаты дает культура, которая находится в стадии физиологической зрелости.

Готовую культуру стерильно переносят в посевной аппарат (малый инокулятор) с предварительно простерилизованной питательной средой. Посевной аппарат оснащен мешалкой, аэрирующим устройством, а также контрольно-измерительной аппаратурой для регулирования рН среды, температуры и степени аэрации.

Масштабирование при получении инокулята желательно осуществлять тогда, когда рост популяции происходит с максимальной скоростью, т.е. в экспоненциальной фазе.

ВЫДЕЛЕНИЕ, КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ И ОЧИСТКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОДУКТОВ

Процесс выделения и очистки представляет собой рядпоследовательных технологических операций, количество которых возрастает с повышением желаемой чистоты конечного продукта.

Культуральная жидкость весьма чувствительна к различным воздействиям, поэтому наблюдаются потери при выделении конечного продукта. Культуральная жидкость представляет собой сложную многофазную систему, содержащую от 1 до 5% и более сухого вещества, отдельные микробные клетки или мицелий, продукты биосинтеза и остатки питательной среды. Как правило, выделение конечного продукта связано с определенными трудностями и в основном зависит от предварительной очистки нативного раствора.

Первой стадией подготовки культуральной жидкости для дальнейшейпереработки является отделение взвешенной фазы или микробной массы, в состав которой входят микроорганизмы, продукты их жизнедеятельности,а также остатки неиспользованной питательной среды. Разделение твердой и жидких фаз проводят с предварительной коагуляцией высокомолекулярных веществ с последующим естественным (отстаивание и фильтрация) или принудительным осаждением центрифугах.

Эффективным методом коагуляции дисперсных систем является обработка их высокомолекулярными полиэлектролитами – флокулянтами. При этом в отличие от обычной коагуляции образуются флокулы или осадки рыхлой структуры, что значительно улучшает процесс фильтрации.

Основное преимущество центрифугирования по сравнению с другими методами обработки неоднородных систем, например, отстаиванием и фильтрованием заключается в увеличении производительности разделения. Производительность современных центрифуг непрерывного действия достигает сотен м³/ч. С помощью центрифугирования удается выделить из суспензий частицы размером до сотых долей микрометра. Центрифугирование широко применяется в биотехнологических производствах лекарственной продукции, прежде всего для выделения из культуральной жидкости меристемы растений, биомассы дрожжей, бактерий, грибов, отделения различных продуктов микробиологического синтеза (антибиотиков, ферментов, витаминов и т.п.), переведенных предварительно в твердую фазу, а также для разделения эмульсий, образующихся при экстракции.

Для извлечения внутриклеточных продуктов биосинтеза широко используются методы дезинтеграции. Дезинтеграция, т.е. разрушение клеточных оболочек микроорганизмов, осуществляется несколькими способами: химическими, биологическими, физическими (механическими).

Химические способы дезинтеграции основаны на деструкции упорядоченных структур клеточной стенки микроорганизма. Наиболее известные химические способы: обработка клеточной суспензии непосредственно щелочью, мочевиной, глицерином, аммиаком, перекисью. Химический способ предназначен для выделения суммарных белков пищевого назначения ине нашел широкого применения в химической и фармацевтической промышленности вследствие невозможности получить чистый продукт.

Биологические способы осуществляются при помощи литических ферментов.

Физические способы. Физическая (механическая) дезинтеграция - это процесс, происходящий при высоких скоростях и сопровождающийся быстрым перемешиванием разрушаемого материала в зоне действия дезинтегрирующих сил. Физическую дезинтеграцию можно проводить в непрерывном режиме с автоматизацией процесса. Наиболее известные способы разрушения биоматериала - замораживание и оттаивание, ультразвуковое воздействие, истирание клеток, экструзия.

Если целевой продукт представляет собой растворимый метаболит или он синтезируется внутри клетки и не секретируется в культуральную жидкость, то прибегают к следующим методам выделения: экстракции, сорбции, хроматографии, выделению с помощью мембран.

Экстракцию проводят органическими растворителями изклеток (например, антибиотика гризеофульвина ацетоном, или бензилпенициллина при рН 2,0-3,0 – бутилацетатом). Экстракция ферментов осуществляется в двухфазных системах, например, глюкана-декстрана инесовместимого с ним полиэтиленгликоля.

Метод адсорбции применяют в микробиологических производствахв основном при получении кристаллических аминокислот, а также высокоочищенных и иммобилизованных ферментов. При выделении и иммобилизации ферментов используют органические сорбенты (крахмал, целлюлозу, синтетические и ионообменные смолы) или неорганические (цеолиты, гидроксид алюминия, силикагели и др.).

Процессы адсорбции осуществляют в аппаратах периодического или непрерывного действия с неподвижным или подвижным слоем адсорбента. Перспективны адсорберы с кипящим слоем адсорбента. Вертикальные адсорберы (ионнообменники) используются для выделения из культуральных жидкостей аминокислот, последние при прохождении через слой ионита адсорбируются, а сопутствующие примеси отводятся из колонны с отработанной культуральной жидкостью. После насыщения смолы аминокислотой подачу культуральной жидкости прекращают и смолу промывают водой, после чего смола готова к повторному циклу.

Хроматографическое разделение БАВ используют в различных вариантах: гель-фильтрация, ионнобменная хроматография, аффинная хроматография.

В случае афинной хроматографии используют высокую специфичность таких природных веществ, как ферменты, антитела и лектины. Ферменты образуют комплексы с ингибиторами, антитела - с соответствующими антигенами (иммуносорбционная хроматография), лектины - со специальными рецепторами клеточных стенок.

К мембранным методам разделения относятся диализ и электродиализ, обратный осмос, ультрафильтрация и микрофильтрация. Общность всех мембранных методов разделения заключается в том, что основным элементом их аппаратурного оформления являются мембраны.

Мембранные методы разделения обладают рядом преимуществ:

- концентрирование и очистка происходят без изменения агрегатного состояния и фазовых превращений;

- перерабатываемый продукт не подвергается тепловым и химическим воздействиям;

- механическое и гидродинамическое воздействие на биологический материал незначительно;

- легко обеспечивают герметичностьи асептические условия.

Основные ограничения в применении мембранных методов разделения связаны с тем, что некоторые материалы, из которых изготавливаются мембраны, не выдерживают очень низких и очень высоких значений рН и высоких температур.

СУШКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ

Получаемая в конце цикла культуральная жидкость содержит от 0,1 до 5% сухих веществ. На последующих стадиях из нее извлекают полезные продукты (биомасса, антибиотики, ферменты, аминокислоты и другие вещества), которые затем превращаются в конечную товарную форму.

Большинство продуктов биологического синтеза выпускаются в сухом виде с остаточной влажностью не более 5-12%.

Удаление влаги и тепловое воздействие в ходе сушки биомассы ведут к существенным изменениям, влияющим на качество готового продукта. Наибольшие трудности возникают при необходимости сохранить такие термолабильные объекты, как живые микроорганизмы (бактериальные препараты) или ферментные препараты. Основными причинами их термолабильности являются денатурация белка и инактивация ферментов при тепловом воздействии, увеличение концентрации электролитов и токсичных веществ при удалении влаги, а также структурныеи механические повреждения в процессе сушки.

По исходному агрегатному состоянию влаги различают следующие методы сушки: сушку из жидкого состояния, испарение из твердого состояния, минуя жидкую фазу - сублимацию.

Сушка культуральной жидкости или биомассы осуществляется контактным, конвективным и радиационным способом.

При контактной сушке тепло передается высушиваемому материалу через нагретые поверхности и испаряющаяся влага переходит в воздух. Для сушки продуктов биологического синтеза применяются одно- и двухвальцовые шкафные сушилки.

При конвективной сушке тепло, необходимое для процесса сушки, доставляется газообразным сушильным агентом, который играетроль теплоносителя и среды, в которую переходит влага из материала. Этот метод широко применяется для сушки продуктов биологического синтезаи, прежде всего, в пневматических, аэрофонтанных, распылительных сушилках и сушилках в кипящем слое.

Поскольку большинство продуктов биологического синтеза являются термолабильными веществами, то для их сушки применяются наиболее щадящие методы. При этом стремятся снизить температуру и время сушки. Для этих целей используют вакуум или сушку тонкодисперсного материала. Еще более выгодные условия для сушки термолабильных веществ создаются при сублимации.

Сублимационный метод сушки основан на удалении влаги из замороженного состояния, причем, влага переходит в газообразную фазу, минуя жидкую.

Характерными особенностями сублимации являются минимальные по сравнению с другими методами сушки изменения структуры высушиваемого материала и более низкие температуры высушивания. Поэтому сублимационная сушка применяется для особо термолабильных продуктов, например живых микроорганизмов, ферментов, некоторых антибиотиков.

Причиной гибели клеток может быть чрезмерное обезвоживание в процессе сублимационной сушки. Для защиты клеток от гибели при замораживании и последующем высушивании применяются специальные защитные среды, включающие глицерин, сахарозу, поливинилпирролидон и другие вещества, замедляющие образование внутриклеточного льда, уменьшающие концентрировании электролитов и защищающие клетки от грубого необратимого обезвоживания.

Полученные сухие продукты биосинтеза обычно используются в измельченном состоянии. Иногда, при распылительной сушке дополнительного измельчения высушенного продукта не требуется. В других случаях, когда готовый продукт предварительно очень быстро должен растворяться или смешиваться до гомогенного состояния, вводят операцию измельчения.

Измельчение зависит от размера кусков исходного материала и соответственно делится на несколько классов:

- дробление - крупное, среднее, мелкое;

- помол - грубый, средний, тонкий, коллоидный.

Высушенные порошковидные препараты трудно дозировать, расфасовывать и транспортировать. Для увеличения средней плотности, уменьшения объема и снижения пылеобразования препараты гранулируют. Известны различные способы гранулирования: экструзия с последующим центробежным скатыванием, псевдоожижение и орошение жидкостью порошка с нанесением глазированной пленки на поверхность гранулята, прессование и формовкас помощью формовочных машин сухим или жидким способом.

Для объемного напорного дозирования жидких сред в точных и регулируемых количествах используют насосы и дозировочные агрегаты.

Для дозирования и расфасовки сыпучих материалов предназначены пневматические дозаторы, автоматические дозировочные весы, весовыбойные аппараты, ленточные дозаторы, вибродозаторы.

В значительной степени эффективность фармацевтического производства зависит от постановки микробиологического контроля. Контролируются музейная культура микроорганизма-продуцента, посевной материал, питательные среды, воздух, культуральная жидкость, а также готовая продукция. В зависимости от назначения микробиологической продукции предъявляются различные требования к ее обсемененности. Продукты, используемые в медицинской промышленности, должны быть практически свободными от микроорганизмов.

Одна из главных задач биотехнологического производства – поддержание в активном состоянии производственного штамма. В процессе неоднократных переносов микроорганизмов, а также длительного воздействия условий культивирования с течением времени могут возникнуть спонтанныемутации, которые приводят к снижению продуктивности производственной культуры. В связи с этим периодически, два раза в год, а вотдельных случаях и чаще проводят пересевы производственного штамма и отбор вариантов с наиболее высокой продуктивностью.

Биохимический контроль количества и специфической активности продуктов микробиологического синтеза позволяет проследить за выходом промежуточного и конечного продуктов. Этот вид контроля обеспечивает выпуск фармацевтической продукции, отвечающей требованиям стандартов.

СТАНДАРТИЗАЦИЯ БИОПРЕПАРАТОВ

По мере дальнейшего развития биотехнологии все более остро встает проблема контроля качества сырья, используемого для составления питательных сред, и качества продуктов биосинтеза. В настоящее время сырье и питательные субстраты для микробного промышленного биосинтеза оценивают по составу тех или иных компонентов, связанных с качеством.

Исключительно важен контроль качества продуктов биосинтеза, используемых в медицине: антибиотиков, ферментов, других биоорганических соединений.

В соответствии с официальной методикой существует классификация показателей для оценки качества микробиологической продукции. Показатели назначения характеризуют свойства продукции, определяющие основные функции, для выполнения которых она предназначена, и обусловливают область ее применения. К группе показателей назначения относятся две важные подгруппы: показатели состава и показатели функциональной эффективности.

Показатели содержания основного вещества включают:

- содержание (%) сырого протеина в дрожжах в пересчете на абсолютно сухое вещество (АСВ);

- содержание (%) белка в пересчете на АСВ;

- содержание (г) антибиотиков на 1 кг препарата;

- содержание (мг) витамина на 1 кг препарата;

- титр препарата;

- активность ферментных препаратов;

- коэффициент биологической активности;

- другие показатели.

Показатели содержания посторонних примесей:

- содержание (%) углеводородов в белке;

- содержание металломагнитных примесей в белке;

- содержание в продукции веществ, отличных по составу от основного компонента и снижающих качество продукции;

- содержание (%) золы в пересчете на АСВ и др.

Показатели структуры и физико-химические характеристики:

- крупность частиц;

- влажность (%);

- насыпная масса (г/л);

- скорость растворения;

- плотность (г/см³) и др.

Контроль качества биопрепарата по показателям назначения сводится к анализу его состава и физико-химических свойств.

Качественные характеристики продукции (внешний вид, цвет,запах, вкус) рекомендуется определять органолептическим методом всравнении с базовым образцом.

Также любой биотехнологический препарат (например, вакцина) подвергается стандартизации (контрольная проверка готового продукта) с помощью следующих тестов:

1) тест на стерильность;

2) тест на присутствие консерванта;

3) проверка на присутствие адъювантов (например, алюминиевые квасцы);

4) проверка на активность и идентичность.

Проверке подлежат документация, образцы, маркировка и упаковка. Все вышеперечисленные тесты необходимы для того, чтобы готовый продукт обладал необходимыми свойствами: был безопасен, надёжен и обладалнеобходимыми профилактическим или лечебным действием. Международные рекомендации (рекомендации ВОЗ), касающиеся таких требований, облегчают обмен биологическими препаратами между отдельными странами и служат руководством для работников, ответственных за изготовление этих препаратов, а также для тех, кто принимает решение по вопросам, касающимся методов их анализа и контроля.

КОНТРОЛЬ И УПРАВЛЕНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИМИ ПРОЦЕССАМИ

На современном этапе развития биотехнологического производства лекарственных, профилактических и диагностических средств высокое качествопродукции может быть достигнуто с учетом ряда общих требований к организации и контролю производства. Такие требования должны предупреждать возможные ошибки при проведении технологических процессов и вести к созданию экологическибезопасных предприятий.

Их общее название - GMP расшифровывается как "Good Manufacturing Practice" и переводится как "Правила хорошего (или надлежащего) производства".

GMP следует понимать, как единую систему требований по организации производства и контролю качества любых лекарственных средств от начала переработкисырья до производства готовых продуктов, включая общие требования к помещениям, оборудованию и персоналу; они также полностью распространяются на все биотехнологические производства, занятые изготовлением лекарственных средств.

Правила GMP содержат лишь минимальные практические указания, но являются общим руководством, регламентирующим, как должен быть органи­зован производственный процесс и как должны быть организованы контрольные испытания.

Существуют национальные GMP (у более чем 40 стран - США, Япония, Германия, Индия и др.), региональные GMP (ЕЭС), GMP ВОЗ. Правила, разработанные ВОЗ, составляют один из основных элементов "Системы удовлетворения качества фармацевтических препаратов в международной торговле, которая рекомендована всем странам-членам ВОЗ. Она является особым видом многостороннего соглашения с целью оказания помощи органам здравоохранения импортирующих (в том числе развивающихся) стран в оценке юридического статуса и технического уровня закупаемых ими лекарственных средств. Она дает определенную гарантию странам-импортерам.

Следует отметить,что требования GMP относятся только к препаратам медицинского применения.

Все национальные и другие правила GMP включены в сборник "International drug GMP", который периодически переиздается (в США).

Правила GMP - национальные, региональные, международные, - содержат следующие основные главы: введение, терминология, персонал, здания и по­мещения, оборудование, процесс производства и экологическая безопасность,лабораторный контроль, регистрация и отчетность.

Не анализируя подробно всех частей соответствующего официального документа (документов), отметим отдельные требования по некоторым из разделов.

Требования к персоналу связаны с уровнем его квалификации, состоянием здоровья, личной гигиеной, порядком использования технологической одежды и обуви, материалами для их изготовления (например безворсовая ткань), переподготовкой и медицинскими осмотрами персонала.

Требования к зданиям и помещениям уточняют их расположение, планировку с целью, например, предотвращения смешения различных видов и серий исходного сырья, полупродуктов и готовых лекарственных средств. Перечисляются специальные помещения для проведения конкретных технологических операций и т.д. Небезынтересно в этой связи отметить, что в ряде национальных руководств по GMP указывается, в частности, на технологические операции, связанные с производством, обработкой и упаковкой антибиотиков пенициллинов и цефалоспоринов, которые рекомендуется проводить в помещениях, изолированных от тех, где изготавливаются другие лекарственные средства. Это объясняется тем, что беталактамы могут проявлять аллергенное действие в крайне незначительных количествах, попадающих в другие лекарственные средства, для того, чтобы у сенсибилизированных больных возникли серьезные осложнения.

Значительное внимание уделяется в GMP облицовочным материалам, сантехнике и вопросу поддержания чистоты в помещениях.

Под особый контроль попадают помещения, где производятся стерильные лекарственные средства - в отношении их изолированности, особенностей планировки, вентиляции, поддержания постоянной разности давлений между отдельными помещениями в 3-5 мм вод.ст., причем, в помещениях более высоких классов чистоты давление должно быть выше. Нестерильные лекарственные средства не должны производиться в тех помещениях, где изготовляется стерильная продукция.

Многочисленны требования GMP к конструкции, размерам и расположению оборудования, особенно используемого при производстве стерильных лекарственных средств. В качестве одного из примеров можно отметить указание на то, что при производстве инъекционных препаратов следует избегать фильтров, отделяющих волокна. Если они вынужденно применяются (асбест и т.п.), после них следует использовать дополнительные мембранные фильтры с размером пор не более 0,45 мкм.

Во всех GMP даются подробные указания, имеющие целью оптимальное проведение всех этапов процесса производства. Правила касаются: 1) отбора проб, контроля качества сырья; 2) осуществления контроля непосредственно за процессами производства, обработки, упаковки. Даются правила для переработки бракованных серий.

Применительно к производству антибиотиков (стадия ферментации) непосредственно относится указание на карантин, которому должно подвергаться сырье (т.е. компоненты, входящие в комплексные среды), на необходимость статистических критериев вариабельности компонентов сырья, на проверку определенных видов сырья на пирогенность.

Нормируется содержание микроорганизмов в воде для очистки и промывки получаемых лекарственных средств.

Контроль процесса производства лекарственных препаратов должен осуществляться в соответствии с технологической документацией. Следует отметить, что правила GMP разных стран не совпадают с предлагаемыми методами стерилизации готового продукта. В целом преимущество отдается термическим методам стерилизации. GMP некоторых стран допускают также радиационную стерилизацию и стерилизацию окисью этилена.

Большое внимание в GMP уделяется обеспечению четкого выполнения производственных инструкций.

Подробно регламентируется перечень документов, точек контроля, воз­можных отклонений от принятых норм. Регламентируются способы фиксации результатов.

Набор требований по регистрации и отчетности, содержащийся в GMP, позволяет проследить за ходом выполнения производственного процесса и точно установить в случае необходимости всю последовательность действий персонала, приведшую к отклонению качества продукта от требуемого параметра.

Само собой разумеется, что правила GMP предусматривают строгую регламентацию тех выбросов, которые могут поступать от фармацевтических и биотехнологических предприятий в окружающую среду. Правила рекомендуют практически полное предотвращение поступления штаммов-продуцентов рекомбинантных белков в стоки и газо - воздушные выбросы, исключение попадания аллергенноактивных продуктов микробиологического синтеза в атмосферу с помощью различных технических решений, предотвращение сброса со сточными водами биотехнологических полупродуктов, способных повлиять на активность и состав биоценозов, используемых на установках биологической очистки загрязненной воды.

Имеющие силу закона в ряде стран правила GMP позволяют предприятиям выпускать конкурентоспособную продукцию. Как показал международный опыт внедрения в медицинскую практику новых лекарственных препаратов, производимых биотехнологическими способами, организация их предварительных испытаний также должна подчиняться определенным правилам. Официальные инстанции, дающие разрешение на промышленный выпуск нового препарата, требуют соблюдения этих правил и соответствующего оформления документации. Всем этим повышается достоверность и объектив­ность экспериментальных результатов и результатов испытаний в клинике.

Правила GLP расшифровываются как "Good Laboratory Practice", что означает правильную (надлежащую) организацию проведения лабораторной работы при исследовании препарата. Правила GLP охватывают всю систему предклинических испытаний. В качестве лишь одного из примеров отметим, что правилами предъявляются определенные требования к планировке помещений вивария, где содержатся подопытные животные, к условиям содержанияживотных, их подбору и т.п. Организация предклинических лабораторных испытаний должна обеспечивать объективность при сопоставлении данных в контроле и опыте.

Весьма существенное значение для разрешения на промышленный выпуск нового препарата имеют правила GCP "Good Clinical Practice", т.е. надлежащая организация работы при проведении клинических испытаний. Соблюдение правил GCP позволяет получать объективные результаты и дает определенные гарантии приближения к максимальной безопасности в случае впервые вводимых человеку препаратов.