Векторные системы трансформации растений

В естественных условиях двудольные растения подвергаются трансформации Ti– и Ri–плазмидами агробактерий. Размер Тi–плазмид 140 – 250 000 полинуклеотидов. В процессе инфекции фрагмент этих плазмид размером около 25 000 полинуклеотидов, называемый Т-ДНК, переносится в растительные клетки и ковалентно связывается с ядерной ДНК. Трансформированные Тi–плазмидами клетки становятся опухолевыми и образуют корончатые галлы. Гены, расположенные на Т-ДНК, активно транскрибируются, вызывая не только неконтролируемый рост трансформированных растительных клеток, но и появление необычных аминокислот, – октопина, нопалина и других опинов. Октопин состоит из аргинина и пировиноградной кислоты, а нопалин представляет собой соединение аргинина и α-кетоглутаровой кислоты. Эти аминокислоты могут использоваться бактериями A. tumefaciens в качестве источника углерода, азота и энергии, если они содержат Тi–плазмиды, которые несут информацию об их катаболизме. В изолированном виде такие клетки размножаются без фитогормонов, синтезируя опины, а в случае прививки их на здоровые растения также образуют корончатые галлы.

Существует несколько типов Ti - плазмид, отличающихся друг от друга структурой опинов. Рис.1.

Гены синтетаз опинов находятся в Т-ДНК, а гены, осуществляющие катаболизм этих опинов – вне ее. Такое расположение генов синтеза и распада опинов соответствует их биологическому назначению: синтез опинов ведут опухолевые клетки, содержащие Т-ДНК, а их деградацию – клетки A. Tumefaciens, обладающие Ti-плазмидами.

Т-ДНК ограничены несовершенными прямыми повторами, состоящими из 25 п.н. Для переноса Т-ДНК важен только его правый повтор; делеция левого повтора ведет к переносу всей плазмиды. Признак онкогенности обеспечивается двумя локусами: onc, располагающимися в Т-ДНК и содержащими гены онкогенности, а также vir, отвечающими за перенос Т-ДНК в растительные клетки. Локусы vir у этих плазмид физически гомологичны и взаимозаменяемы. Они включают около 25 генов, организованных в 7 оперонов и обеспечивающих синтез бактериальных белков-рецепторов, белков, ответственных за образование цитоплазматического мостика между бактериальной и эукариотическими клетками, вырезание, упаковку и транспорт Т-ДНК. Интересно, что Т-ДНК агробактерий безоперонная, т.е. по структуре эукариотическая. (Рис. 2.)

Локус onc Т-ДНК включает в себя шесть генов. Продукты генов 1 и 2 превращают триптофан в ИУК, а изопентилтрансфераза, кодируемая геном 4, синтезирует один из вариантов цитокинина. Высокий внутриклеточный уровень этих гормонов приводит к повышенной митотической активности трансформированных клеток и, как следствие, к образованию опухоли. Свой вклад в дедифферинцировку клеток вносят также продукты генов 5, 6а и 6b.

Фенотип каллуса, полученного из трансформированных клеток, зависит от мутаций в генах onc. Мутации в генах 1 и 2 приводят к формированию побегов, мутации в гене 4 обуславливают развитие корней, мутации в генах 6а и 6b приводят к увеличению размеров каллуса. Отсюда происходят и названия групп этих генов – tms, tmr, tml (tumour morphology shooty, rooty, large соответственно).

В опухолевых клетках Т-ДНК интегрирована в разных, преимущественно активно транскрибируемых участках ядерной ДНК. Нопалиновая Т-ДНК в растительном геноме представляет собой непрерывную последовательность нуклеотидов из 23 т.п.н., причем имеется несколько ее копий. Октопиновая Т-ДНК состоит из сегментов T_L (13,6 т.п.н.; одна копия не геном) и T_R (6-7 т.п.н.; 15-30 копий на геном).

Т-ДНК фактически являются природными экспрессионными векторами. Они стабильно поддерживаются в реципиентных клетках, переносят в них чужеродную ДНК, которая транскрибируется с образованием функционально активных белков, а селективным маркером служит признак онкогенности трансформированных клеток. Учитывая, что структурными элементами, необходимыми для переноса служат концевые повторы, после делетирования центральной части Т-ДНК последняя сохраняет способность к переносу. Одновременно делетирование центральной части предотвращает образование опухолеродных клеток, что важно, поскольку из таких трансформированных клеток нельзя получать целые растения. Это привело к мысли о конструировании векторов на базе Т-ДНК путем замены их центральной части чужеродными генами, которые в составе Т-ДНК будут естественным образом переносится в растительные клетки и интегрироваться в геном.