Клонирование генов

Выделение генов

Донорная система

Реципиентная система (протопласты)

Протопласты представляют собой голые клетки, окружённые цитоплазматической мембраной. Отсутствие клеточной стенки делает возможным поглощение протопластами органелл, микроорганизмов и чужеродного генетического материала.

Протопласты выделяют чаще всего из мезофильных клеток молодых листьев или из суспензионной клеточной культуры. Препараты отдельных клеток получают механическим путём. Фрагменты листьев измельчают в стеклянном гомогенизаторе, разрушая ткань до отдельных клеток. Затем обрабатывают пектиназами для удаления межклеточных связей, а затем целлюлазами для удаления самой клеточной стенки. После этого их можно поместить на плотные среды, где через 5-10 дней происходит регенерация клеточной стенки и начинается деление клеток. Дальнейшее развитие процесса идёт стандартным образом:

	Образование каллуса (дедифференцированная клеточная масса)

Становление целого растения

Формирование побегов и корней (под влиянием ауксинов и цитокининов)

Как известно, геном ядра клеток высших растений содержит большое количество ДНК. Выделение фрагмента ДНК с известной нуклеотидной последовательностью, составляющий определённый ген, из десятка миллионов подобных - представляет собой непростую задачу.

Существуют несколько способов решения:

1. Химический синтез гена.

Возможен при наличии подробной информации о нуклеотидной последовательности соответствующей ДНК и, как правило, объектом синтеза являются гены, кодирующие относительно небольшие белки (например, соматостатин – 14 аминокислот).

2. Выделение полноразмерных генов из клонированных последовательностей ДНК с помощью зондов, созданных на основе химического синтеза (50 – 180 оснований).

Представляет собой выделение и амплификацию индивидуальных последовательностей генов путём репликации в бактериальной системе. Одним из методов является выделение кДНК, т.е. структурной части гена, который предшествует получение индивидуальной иРНК:

иРНК составляет 1 – 5% всей клеточной РНК (80% - рибосомная и 10 – 15% - транспортная) и на 3′ - конце имеет polyA – фрагмент, длина которого достаточна для очистки иРНК с помощью аффинной хроматографии на олиго- (dT)-целлюлозе. Получаемая гетерогенная популяция молекул иРНК кодирует белки, синтезируемые в данный момент клеткой. Затем обычно иРНК фракционируют по размеру при помощи центрифугирования в градиенте плотности сахарозы и изучают на наличие интересующих последовательностей при помощи трансляции in vitro (в лизатах, полученных из зародышей пшеницы или ретикулоцитов кролика, и содержащих все компоненты, необходимые для синтеза белков). Продукты трансляции анализируют при помощи электрофореза на SDS – ПААГ и так как при трансляции in vitro использовались радиоактивно меченные аминокислоты – это позволяет идентифицировать их авторадиографией.

Обнаруженный нужный транскрипт иРНК копируют в ДНК с помощью обратной транскриптазы, образовавшуюся ДНК (кДНК) включают в плазмиды и вводят в бактерии путём трансформации. Клоны бактерий, несущие участок чужеродной ДНК, отбирают из многочисленного окружения нетрансформированных клеток путём гибридизации in situ с радиоактивно мечеными пробами (примерно 15 нуклеотидов).