Трансформация агробактериями

Маркеры.

В случае использования неонкогенной Т-ДНК необходимы маркеры трансформирования растений. В этом качестве используют не сами гены onc и nos, а их промоторы и сайты полиаденилирования, между которыми помещают бактериальные селективные маркеры. Это неомицинфосфотрансфераза (neo, устойчивость к аминоглкозидным антибиотикам канамицину и неомицину), гигромицинфосфат трансфераза (hpt, устойчивость к гигромицину), хлорамфениколацетилтрасфераза (cat, устойчивость к хлорамфениколу), дигидрофолатредуктаза (dhfr, устойчивость к метотрексату) и др.

Способностью трансформировать клетки двудольных растений обладают также некоторые плазмидосодержащие штаммы A.risogenes. У растений, зараженных этими бактериями, провоцируется образование ткани, которая получила название косматого корня. Поэтому плазмиды, вызывающие этот эффект, называют Ri-плазмидами (root-inducing). Генетические карты сходны с Ti-плазмидами. Инфекционной частью Ri-плазмид также является Т-ДНК. Однако трансформированные клетки неонкогенны. Они синтезируют опины, быстро растут в культуре и из них можно регенировать здоровые плодовитые растения. Поэтому такие плазмиды более привлекательны. На их основе были созданы интегративные и бинарные векторы.

3.2. Трансформация растительных клеток

В зависимости от цели экспериментов и степени изученности объекта возможно несколько способов трансформации растительных клеток агробактериями и регенерация из них целых растений. Простейший из способов предложен для модельных растений. Из молодых листьев готовят диски размером несколько миллиметров, стерилизуют их поверхность и инокулируют в жидкую среду, которая содержит агробактерии, несущие рекомбинантные векторы. При этом происходит инфицирование растительных клеток, находящихся на краях диска. После двух дней культивирования диски переносят на плотную среду с карбенициллином (убиение агробактерий), канамицином (отбор растительных клеток, приобретших ген neo) и высоким содержанием цитокинина (индукция образования побегов). На этой среде сначала в отдельных местах по краям диска происходит образование каллуса, из которого через 2-4 недели развиваются побеги. Затем каллус с побегом отделяют и переносят на среду с повышенным содержанием ауксина, индуцируя образование корней. Через дополнительные 2-4 недель растение переносят в почву.

При работе с новыми видами растений в предварительных опытах, используя онкогенные агробактреии, определяют, какие экспланты подходят для таких опытов. Ими могут быть сегменты листьев, стебля, клубня, корня, черешка, проростка или размножаемые in vitro растения. Затем опыты повторяют с неонкогенными агробактериями. Далее каллус или нити косматого корня переносят на плотную питательную среду и, меняя состав сред и условия культивирования, добиваются регенерации растений по первой схеме.

Клон трансформированных клеток получают исходя из их протопластов. Протопластирование является надежным методом получения изолированных растительных клеток. В подходящих условиях протопласт заново синтезирует клеточную стенку и вступает в митоз. Синтез ДНК служит сигналом о готовности растительной клетки к ее трансформации агробактериями. В этот момент, который наступает через неделю после начала культивирования протопластов в жидкой среде, к ним добавляют агробактерии. После 1-2 недель дополнительного культивирования, образовавшиеся в суспензии микроколонии растительных клеток (они после деления не расходятся) высевают на плотную селективную среду. Через 3-6 недель на чашках образуется каллус, из которого затем можно регенерировать целое растение. Именно такое растение будет трансгенным, если инфицирующие агробактерии содержали рекомбинантную ДНК.

Метод переноса чужеродных генов в растения с помощью агробактерий не является универсальным. Основным недостатком является ограничение по кругу хозяев. Лишь в единичных случаях удавалось трансформировать однодольные растения агробактериями. Например, оказалось возможным индуцировать образование корончатого галла у батата Discorea bulbifera (однодольное растений), инфицированного клетками агробактерий, у которых vir область была предварительно индуцирована ацетосирингонами пораненного картофеля (двудольное растение). Но проблема ограничения связана не только с однодольными. Для многих видов культурных двудольных тоже пока не найдены условия их трансформации и/или регенерации целых растений из изолированных клеток. В таких случаях для трансформации используют препараты изолированной ДНК.