Методы исследования развития икры рыб

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ИКРЫ РЫБ

Лекция 11

Исследование развития икры рыб проводят многими способами, такими как исследование эмбриологии личинки на фиксированном ма­териале (залитым в какую-либо среду), прижизненное исследование раз­витие икры (наблюдение под микроскопом изменений внешнего вида личинки и зародышевых структур, внутри оболочки) и т. д.

Зная закономерности влияния факторов среды, в частности тем­пературы, на характер роста, эффективность использования запасных веществ желтка и динамику энергетических затрат в процессе развития рыб, на ранних этапах онтогенеза появляется возможность опреде­ления оптимальных значений факторов среды и регуляции развития, т. е. управления развитием и ростом. Это необходимо с целью получе­ния особей не только в заранее планируемые сроки, но и с заданными морфофункциональными параметрами. Полученные значения позволяют до­статочно четко определить наиболее оптимальные значения темпера­тур для этого вида.

Одним из видов исследования развития молоди рыб является эколого-морфологическое направление.

В этом аспекте были исследованы на последовательных стадиях раз­вития форма тела, форма и функция плавников, пищеварительная и цен­тральная нервная системы, ротовой и глоточный аппараты, органы зре­ния и органы боковой линии. При исследовании экологии рыб особое внимание обращали на места обитания, поведение и характер питания. Некоторые экологические особенности устанавливали на основании строения рыбы на данном этапе развития. Например, об отношении за­родыша к кислороду судили по строению кровеносной системы и харак­теру его движения.

Исследование строения рыб на последовательных стадиях развития позволило установить ряд закономерностей. Было установлено, что пе­реход с одного этапа развития на другой происходит скачкообразно и что размеры рыб на каждом этапе, хотя и варьируют в определенном диапа­зоне, постоянны для каждого вида.

Размеры молоди на каждом этапе могут варьироваться сильнее или слабее в зависимости от окружающих условий. При неблагоприятных ус­ловиях размах вариаций увеличивается и размер молоди на более позд­нем этапе развития может оказаться меньше размера ее на более раннем этапе. В одновозрастной популяции часть молоди, отставшая в развитии, переходит на следующий этап позже своих сверстников. Таким образом, в популяции возникает разнокачественность (разноэтапность), одновозрастная популяция оказывается состоящей из рыб, находящихся на разных этапах, т. е. в различных отношениях с окружающей средой, что позволяет виду полнее использовать все возможности водоема и тем са­мым увеличить его численность.

Характеристика нерестилищ. Нерестилища обнаруживаются путем непосредственного наблюдения за рыбами в процессе самого нереста или по наличию кладок икры и только что вылупившейся молоди дан­ного вида. При их описании надо указывать, кроме места нереста (река, прибрежная ее часть, русло, полой и т. д.), его глубину, характер грунта, наличие или отсутствие течения, его скорость и направление, прозрач­ность воды, ее температуру, содержание кислорода и рН, а также степень загрязнения отходами промышленности, детергентами и т. д. — фактор, который в настоящее время нельзя не учитывать.

Скорость течения определяется с помощью вертушек Жестовского и Бурцева, а также измерителя потока типа «Балт». Если их нет — с по­мощью поплавка, изготовленного из любого плавучего материала. Определение скорости течения необходимо повторить 2-3 раза и затем вычислить ее среднюю величину. Направление течения определяют по направлению движения плывущих предметов.

Количество растворенного в воде кислорода определяется по Винклеру два раза в сутки один-два раза в неделю; рН следует определять одновременно с определением кислорода. Методики определения кислорода и величины рН можно найти в любом учебнике по гидрохимии, в частности в руководствах. Прозрачность воды опреде­ляется по диску Секки. Измерять температуру воды как на нерестили­щах, так и при инкубации икры в лабораторных условиях необходимо не менее трех раз в сутки — в 6-7, 13—14, 18—19 часов. Для систематичес­кого наблюдения за изменениями температуры воды на нерестилищах рекомендуется использовать обычный метеорологический термограф с недельным заводом, заключенный в водонепроницаемый корпус.

Оплодотворение и развитие икры. Икру для изучения ее развития по­лучают, собирая на нерестилищах, отсаживая производителей для естес­твенного нереста или путем искусственного осеменения. Искусственное осеменение может быть произведено мокрым или сухим способом. При мокром способе к отцеженной в сосуд икре приливают воду, а затем мо­локи. При сухом способе к отцеженной в сосуд икре приливают молоки, тщательно их перемешивают перышком или насухо вытертым хвостом рыбы, а затем добавляют воду. Через 2—3 мин жидкость сливают и икру заливают свежей водой. Выбор того или иного способа осеменения за­висит от видовых особенностей половых продуктов и условий, в кото­рых производится осеменение. Например, для рыб с донной или клей­кой икрой хорошие результаты дает сухой способ осеменения, а для рыб с пелагической икрой он менее пригоден, так как при осеменении этим способом повреждаются нежные оболочки их икры.

Для искусственного осеменения берут живых или недавно умер­ших рыб с текучими или с вытекающими при легком надавливании на брюхо половыми продуктами. При оплодотворении икры одной сам­ки рекомендуется брать молоки от двух самцов для гарантии качества спермы. Перед осеменением тело производителей вытирают, чтобы удалить слизь и грязь. Выпускать икру и молоки следует так, чтобы они стекали в сосуд по хвосту рыбы. Если икра клейкая, ее несколько раз промывают свежей водой, если пелагическая, то всплывшие икринки переносят сеточкой в высокие сосуды со свежей водой. Клейкую икру при размешивании размазывают в один слой по дну кристаллизаторов, чашек Петри или других аналогичных сосудов. Слипшуюся в комки икру удаляют. Инкубацию икры следует проводить при температуре, близкой к естественной, не допуская нагревания и освещения прямым солнечным светом.

Правила фиксации и хранения материала. Выловленную молодь фик­сируют на месте 5%-ным формалином. Количество фиксирующей жид­кости должно быть больше объема молоди минимум в 4 раза. Банка для фиксации должна быть достаточно большой, чтобы молодь рыб свободно располагалась в фиксирующей жидкости. Через 12 часов 5%-ный фор­малин заменяется на 4%-ный, в котором молодь будет храниться в даль­нейшем. Предварительно из проб выбирается грязь и растительность. На ранних этапах развития молодь лучше фиксировать формалином с пова­ренной солью (7 г соли на 1 л формалина). При такой фиксации хорошо сохраняется форма личинок. Предличинок или личинок помещают в ма­ленькие пробирки, которые плотно затыкают ватной пробкой (предва­рительно вложив в них этикетку) и складывают пробкой вниз в большую банку с 4%-ным формалином. Для гистологической обработки материал фиксируется 10%-ным формалином.

Этикетирование. При сборе материала очень важно правильно его этикетировать. Сразу после фиксации в пробу кладется этикетка, на­писанная на кальке или плотной белой бумаге простым карандашом. Писать этикетки шариковой ручкой нельзя, так как паста для ручки быс­тро обесцвечивается. Этикетки, написанные заранее и высушенные, ре­комендуется предварительно окунуть в спирт и только после того как они просохнут помещать в банку или пробирку с фиксированным материа­лом. В этикетке указывается: дата, место и время лова, температура воды, орудие лова.

Общие правила исследования развития молоди. Для детального иссле­дования развития молоди, главным образом зародышевого периода, луч­ше всего получать материал путем искусственного осеменения, так как датированный материал в естественных условиях получить, как правило, невозможно.

Исследование развития следует проводить параллельно на фиксиро­ванном и живом материале, отмечая все изменения в строении и поведе­нии, а также время до их наступления, прошедшее с момента осемене­ния, а после вылупления из оболочки также с момента вылупления.

При характеристике икры следует отмечать: ее форму, клейкость, цвет, прозрачность, диаметр ее в оболочке и без оболочки, величину перивителлинового пространства. При нахождении икры в природе — глу­бину, на которой была отложена икра, субстрат и характер ее располо­жения на субстрате, заиленность, стадию развития зародыша, которая определяется под микроскопом. Если оболочка икры непрозрачная, ее необходимо снять с помощью глазных пинцетов или препаровальных игл. Икру следует измерять как до, так и после фиксации.

Для характеристики строения молоди на различных этапах развития объекты подробно описываются и зарисовываются. Зарисовывать мо­лодь можно как фиксированную в формалине, так и живую, обездвижи­вая ее слабым водным раствором уретана (примерно 0,5%), хлорэтоном, трикаинметансульфонатом или гидрохлорид-2-метил-4-винилоксихи-нолином. Желательно наряду с рисунком использовать макрофотогра­фию, особенно для живого материала.

Окраска молоди. Для выявления на фиксированном материале не­которых особенностей строения молоди, в частности: границ миотомов, сгущений мезенхимы в плавниковой складке, закладок лучей и чешуи, формы и размера рта и т. д., применяется окраска водным раствором метиленовой сини. Для подкрашивания объекты опускают на несколько секунд в некрепкий раствор метиленовой сини, затем их переносят в чис­тую воду. Также можно поверхность тела личинок подкрашивать кисточ­кой, смоченной в растворе метиленовой сини. Концентрацию раствора и время окрашивания устанавливают опытным путем, так как для раз­ных видов и для личинок разных возрастов они различны. Как правило, личинки на более поздних этапах развития окрашиваются дольше, чем на ранних. Объекты необходимо рассматривать под микроскопом сразу же после окрашивания, так как они быстро раскрашиваются, становятся равномерно голубыми и детали строения снова исчезают.

Для выявления окостенений осевого скелета, скелета плавников, че­люстного аппарата и т. д. употребляют красный ализарин, который окра­шивает костную ткань в красный цвет. В насыщенный в 96%-ном спирте раствор красного ализарина прибавляют по каплям ледяную уксусную кислоту до слабого запаха уксуса и изменения цвета раствора. На 1 часть этого раствора берут 9 частей 70%-ного спирта. Окрашиваемые объекты помещают на 24 часа в полученный раствор, затем их переносят в 96%-ный спирт до прекращения отдачи краски. Хранят в 75%-ном спирте или в 4%-ном формалине. Перед окрашиванием личинок, фиксированных формалином, не отмывают, крупные экземпляры споласкивают водой.

Анализ периодов развития молоди. На основании особенностей стро­ения и поведения молоди рыб в их развитии до наступления половой зрелости выделены зародышевый, личиночный и мальковый периоды, каждый из которых состоит из ряда этапов.

Зародышевый период длится с момента оплодотворения до начала внешнего питания. Последние зародышевые этапы могут проходить, например, у карповых и окуневых, вне оболочки. Наблюдение за эмб­риональным развитием, особенно на ранних этапах, нужно проводить на живом материале, при этом следует отмечать начало набухания икры, образование перивителлинового пространства, дробление, образование бластулы, обрастания бластодермой желточного мешка, начало сегментации тела, закладки органов (глаз, слуховых пузырьков и отолитов в них, хвостовой почки и т.д.), начало кровообращения и сердцебиения, его частоту, появление эритроцитов, возникновение протоплазматической моторики и движения зародыша, развитие желез вылупления и приклеивания, их расположение, стадию, на которой зародыш вылупился, и ко-исбание длины только что вылупившейся молоди. Частоту ударов сердца п число движений зародыш подсчитывают с секундомером в течение I мин. Подсчет повторяют не меньше трех раз и берут среднюю.

Личиночный период длится от начала внешнего питания до исчез­новения личиночных признаков и начала развития чешуйного покрова, после чего молодь переходит на мальковый период, который длится до наступления половой зрелости. У некоторых видов бычков личиночный период развития фактически отсутствует, соответствующие этому перио­ду этапы проходят у них в оболочке икринки.

При описании развития молоди после вылупления на последних зародышевых и личиночных этапах развития следует отмечать: разме­ры молоди на каждом этапе развития, особенно при переходе с этапа на этап и длину тела, на некоторых этапах развития размеры личинок рыб могут служить одним из признаков для их опре­деления); наличие или отсутствие органов приклеивания, их располо­жение; форму желточного мешка (грушевидная, сигарообразная, яйцевидная); наличие жировых капель, их количество (одна большая или много мелких); цвет желтка и жировых капель; количество туловищных и хвостовых миотомов; форму и ширину плавниковой складки; величи­ну и расположение грудных плавников; расположение и величину за­кладки непарных плавников (в спинном, хвостовом и анальном отделах плавниковой складки сгущения мезенхимы внешне имеют вид уплот­ненных участков ткани); развитие лучей в непарных и парных плавни­ках; количество лучей в спинном и анальном плавниках; закладку и раз-иитие брюшных плавников; наполнение плавательного пузыря возду­хом; пигментацию глаз и тела (количество, расположение и форма пиг­ментных клеток используются как признак при определении личинок); форму, размер и положение рта; развитие челюстных зубов; для карпо­вых — развитие жерновка и глоточных зубов, их число, расположение и форма; величину жаберной крышки (закрывает или нет жаберные дуж­ки); появление жаберных лепестков и жаберных тычинок; образование перегородок в обонятельных ямках; начало развития желудка и петель кишечника; начало закладки чешуи.

После перехода на мальковый период развития у молоди следует отмечать форму плавников, их расположение, число лучей в непарных плавниках, развитие чешуи, развитие клапана в обонятельных ямках, за­мыкание канала боковой линии, развитие желудка и петель кишечника, строение челюстных и глоточных зубов; число, величину и форму жаберных тычинок; форму, размер и положение рта.

Для понимания морфоэкологических особенностей отдельных ви­дов рыб на зародышевых и ранних личиночных этапах большое значе­ние имеет строение кровеносной системы, так как на этих этапах она несет функцию органа дыхания и в связи с этим имеет специфические морфологические особенности. Изучать строение кровеносной системы можно только на живом материале. При исследовании следует отмечать, кроме начала сердцебиения, строение и развитие сосудистой системы желточного мешка, сеть кровеносных сосудов в плавниковой складке, особенно в дорсальном и анальном ее отделах, развитие туловищных сег­ментальных сосудов, жаберных сосудов, псевдобранхии и т. д.

Длина молоди и пропорции ее тела. Измерять можно живой или фик­сированный в формалине материал. Необходимо указывать, измерялась живая или фиксированная молодь, так как при фиксации формалином размер молоди уменьшается, причем на ранних этапах он уменьшается сильнее, чем на более поздних. Измерять фиксированную молодь сле­дует не раньше, чем через сутки после фиксации, так как уменьшение ее размера происходит в течение первых суток. Молодь длиной до 18 мм из­меряется при помощи окуляр-микрометра с точностью до 0,1 мм; свыше 18 мм — кронциркулем под бинокуляром; более крупная молодь (свыше 30 мм) — штанген-циркулем.

Чтобы проследить изменения пропорций тела в течение развития и установить границы этапов, на которых происходят эти изменения, под­бирается по длине последовательный ряд молоди: до 10 мм длиной — с интервалом 0,1-0,2 мм, от 10 до 20 мм длины — с интервалом 0,25-0,5 мм, от 20 до 30 мм длины — с интервалом 0,5—1,0 мм. При неболь­шой вариабельности пропорций тела на каждом этапе развития и четко видных изменениях пропорций тела при переходе с этапа на этап можно ограничиться измерением одного экземпляра каждого размера. При зна­чительной вариабельности следует брать по 5-10 экз. каждого размера в зависимости от количества материала и размаха вариабельности.

Длительность этапов развития в лабораторных условиях устанавли­вается прямым наблюдением. В естественных условиях вычисляется по времени, прошедшему от появления в уловах первых экземпляров мо­лоди на данном этапе до появления их на последующем и до появления-1 массового количества молоди на данном и последующем этапах. Для этого необходимы ежедневные ловы молоди, желательно на одних и тех же местах. Длительность периодов развития устанавливается аналогично длительности этапов.

В естественных условиях устанавливается также время, в течение ко­торого в водоеме встречается молодь на каждом этапе развития, и разнокачественность одновременно встречающейся в водоеме молоди — раз-ноэтапность и разноразмерность.

Скорость роста. Для установления скорости роста молоди и колеба­ний ее размеров на каждом этапе необходимо промерять, если в пробе меньше 50 экз., — всю пробу, если больше — 50 экз. При разведении в искусственных условиях, поскольку материал обычно бывает более од­нородным, для измерения при ежедневной фиксации можно брать 10-20 экз. в зависимости от количества материала и его однородности. Для установления весового роста молодь взвешивается на весах. На ранних личиночных этапах взвешивается одновременно по 10—20 экз. одного размера, а затем вычисляется средний вес для данного размера.

Поведение молоди. При наблюдении за молодью следует отмечать: поведение ее после вылупления (подвешивается к растениям, лежит на дне, прячется под камни, делает «свечи» и т. д.), места ее обитания и поведение на различных этапах развития, — реакцию на свет, течение, тактильные раздражения, колебания воды, стук по стенке сосуда. Для проходных и полупроходных рыб — начало ската, размеры мо­лоди, этап, на котором она скатывается, поведение во время ската, обра­зование стай.

Исследования питания молоди. Для определения питания личинок рыб их вскрывают под микроскопом с помощью препаровальных игл, выделяют кишечный тракт, который также вскрывают. Пищевые орга­низмы определяют, по возможности, до вида, подсчитывают число эк­земпляров каждого вида и с помощью окуляр-микрометра измеряют их размер. Измерение пищевых организмов необходимо для определения предельного размера пищи, которую способна захватывать личинка того или иного этапа развития. Кроме того, размер пищевых организмов не­обходим для того, чтобы рассчитать вес пищевого комка.

Для установления характера питания рекомендуется вскрыть не ме­нее 20—25 личинок каждого этапа. У небольших личинок пищевые орга­низмы подсчитывают во всем пищевом комке, с ростом личинок можно анализировать 1/2 или 1/4 его часть. Для облегчения определения ос­татков организмов в пище и установления избирательной способности молоди раз в пятидневку на местах ее лова берутся пробы планктона. В пробу планктона прибавляют на глаз 40%-ный формалин.

При анализе питания молоди следует отмечать начало активного питания, кормовые объекты на всех этапах развития, их видовой и ко­личественный состав, абсолютный и относительный размер, индексы потребления.

Вопросы для самоконтроля

1. Опишите основные правила фиксации и хранения материала.

2. Какие существуют общие правила исследования развития моло­ди рыб?

3. Какую роль играет окраска молоди рыб для исследования этапов развития?

4. Какие периоды развития молоди рыб вы знаете? Чем они отлича­ются?

5. Опишите основные характеристики каждого периода.

6. Охарактеризуйте длительность этапов развития молоди рыб. Какие основные характеристики используются для деления на этапы?

7. Какими способами можно исследовать и оценить питание моло­ди рыб?

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Основная

1. Калайда, М.Л. Общая гистология и эмбриология рыб / М.Л. Калайда, М.В. Нигметзянова, С.Д. Борисова // - Проспект науки. Санкт- Петербург. - 2011. - 142 с.

2. Козлов, Н.А. Общая гистология / Н.А. Козлов // - Санкт- Петербург- Москва- Краснодар. «Лань». - 2004 г.

3. Константинов, В.М. Сравнительная анатомия позвоночных животных / В.М. Константинов, С.П. Шаталова // Издательство: "Академия", Москва. 2005. 304 с.

4. Павлов, Д.А. Морфологическая изменчивость в раннем онтогенезе костистых рыб / Д.А. Павлов // М.: ГЕОС, 2007. 262 с.

Дополнительная

1. Афанасьев, Ю.И. Гистология / Ю.И. Афанасьев [и др.] // - М.. “Медицина”. 2001 г.

2. Быков, В.Л. Цитология и общая гистология / В.Л. Быков // - СПб.: “Сотис”. 2000 г.

3. Александровская, О.В. Цитология, гистология, эмбриология / О.В. Александровская [и др.] // - М. 1987 г.