2018-02-13
3854
Для того чтобы изучить состав и функции тех или иных клеток, применяют метод дифференциального центрифугирования. Он основан на том, что различные клеточные органеллы и включения имеют различную плотность. При очень быстром вращении в специальном приборе - ультрацентрифуге - органеллы тонко измельченных клеток выпадают в осадок из раствора, располагаясь слоями в соответствии со своей плотностью: более плотные компоненты осаждаются при более низких скоростях центрифугирования, а менее плотные - при более высоких скоростях. Эти слои разделяют и изучают отдельно.
Центрифугирование позволяет получить различные фракции субклеточных частиц и исследовать свойства и функции каждой фракции в отдельности. Например, из листьев шпината можно выделить хлоропласты, отмыть их с помощью повторного центрифугирования в соответствующей среде от клеточных фрагментов и исследовать их поведение в различных экспериментальных условиях или же определить их химический состав.
Далее можно, применяя различные модификации методики, разрушить эти пластиды и выделить посредством дифференциального центрифугирования (повторного осаждения частиц при различных величинах ускорения) составляющие их элементы. Таким путем удалось показать, что пластиды содержат структуры, отличающиеся очень упорядоченным строением, — так называемые граны; все граны находятся внутри ограничивающей хлоропласт мембраны (оболочка хлоропласта). Достоинства этого метода просто неоценимы, поскольку он позволяет выявить существование функциональных субъединиц, входящих в состав более крупных субклеточных частиц; в частности, используя метод дифференциального центрифугирования, удалось показать, что граны являются основным структурным элементом хлоропласта.
Применение метода дифференциального центрифугирования сопряжено со многими методическими трудностями. Вопервых, при выделении частиц можно повредить их структуру. Поэтому потребовалось разработать специальные методы разрушения клеток, которые бы не вызывали повреждения структуры субклеточных фракций. Вовторых, поскольку субклеточные частицы обладают мембранами, в процессе их выделения могут возникать разнообразные осмотические эффекты. Следовательно, для того чтобы ультраструктура исследуемых объектов не была разрушена еще при их выделении, необходимо тщательно подбирать состав среды, в которой производится разрушение клеток и осаждение частиц. И наконец, отмывание субклеточных частиц (ресуспендирование их в среде и последующее повторное центрифугирование) может приводить к потере некоторых содержащихся в них веществ, которые под действием сил диффузии переходят в раствор. В связи с этим иногда бывает трудно понять, какие из малых молекул действительно являются элементами исследуемых структур, а какие просто были адсорбированы их поверхностью в процессе выделения. Такое положение затрудняет точное определение некоторых функциональных свойств выделенных объектов. С другой стороны, поскольку результаты исследований оставались неизменными при очень широком диапазоне условий выделения и хорошо коррелировали с данными, полученными иными методами, мы можем сделать общий вывод о том, что большая часть метаболических функций в клетке тесно связана с определенными структурными элементами, которые мы называем субклеточными частицами.
Поскольку всегда остаются некоторые сомнения в отношении истинной биологической функции исследуемых субклеточных фракций, весьма желательно располагать методами, которые бы позволили определять функциональные свойства частиц, не выделяя их из клетки. Частично эта задача решается благодаря использованию цитохимического метода анализа. Общие принципы данного метода восходят к старым микроскопическим методам изучения препаратов, окрашенных специальными красителями. В общем задача состоит в том, чтобы подыскать специфическую цветную реакцию, которая выявляла бы интересующие нас соединения, конечные продукты обмена или последовательности химических реакций. Например, присутствие щелочной фосфатазы в клетках можно выявить, инкубируя срезы ткани или суспензии клеток в растворе фосфорного эфира анафтола. Под действием фосфатазы происходит гидролиз эфирных связей этого соединения и выделение анафтола, который в свою очередь в присутствии соли диазония немедленно вступает с ней в реакцию, образуя окрашенное соединение, отчетливо наблюдаемое под световым микроскопом.
Если все вещества, необходимые для проведения реакции, присутствуют в клетке, то образующееся в конце концов сильно окрашенное соединение будет осаждаться в тех ее участках, где наблюдается активность этого фермента. Таким образом, локализацию щелочной фосфатазы в клетке можно выявить визуально. Одним из преимуществ такого метода является то обстоятельство, что высокая специфичность окрашивания обусловлена специфичностью фермента, расщепляющего связи соединения, химическое строение которого подобно строению веществ, присутствующих в клетке в естественных условиях, а не наличием молекул анафтола. Следовательно, для выявления в клетке других ферментов могут быть использованы соединения, являющиеся какими-либо иными производными анафтола. В частности, по существу аналогичная методика применяется для выявления эстераз и липаз.
