1. Схема выделения жгутиков: целые микробные клетки со жгутиками – встряхивание с бусами в течение 5 мин – центрифугирование при 8000/30 мин. –осадок (целые клетки) удаляют— в надосадочной жидкости находятся жгутики (жгутиковые антигены).
2. Схема выделения капсульной фракции: целые микробные клетки с капсулами – добавляют дистиллированную воду – центрифугируют при 5000/15 мин – осадок ресуспендируют в дистиллированной воде и встряхивают без бус при 3000 колебаний/мин 15 мин – центрифугируют при 10000 об/мни 20 мин – осадок удаляют – в надосадочной жидкости находится капсульная фракция.
3. Схема выделения клеточных стенок: целые микробы – встряхивание с бусами 15 мин – центрифугирование при 5000 об/мин 20 мин – осадок удаляют (неразрушенные клетки) – в надосадочной жидкости находится фракция стенок бактерий.
4. Извлечение соматических антигенов из микробных клеток осуществляется также различным химическими способами: экстрагированием трихлоруксусной кислотой, кислотным гидролизом или ферментативным перевариванием бактерий с последующим осаждением антигена спиртом или сернокислым аммонием и очисткой диализом.
|
|
5. Схема получения экзотоксинов: культивирование токсин-продуцирующих бактерий в жидкой питательной среде до максимума продукции токсина – фильтрация для удаления бактериальных тел – перевод токсина в анатоксин путем длительного воздействия на него формалина при температуре 30-40° С.
Выделенные фракции (субфракции) антигенов из тех или других анатомических структур бактериальных клеток используют для получения специфических сывороток, а они, в свою очередь, применяются для сероидентификации и серотипирования культур, выделенных, от больных или из объектов внешней среды. Многие макромолекулярные соединения микробных клеток являются антигенами, но только часть из них называют иммуногенами, т. е. способными вызвать образование антител — антитоксинов или сенсибилизированных лимфоцитов, принимающих участие в создании иммунитета. Поверхностные структуры бактерий (жгутики, капсула и клеточные стенки) значительно более антигенны, чем внутриклеточные компоненты (цитоплазма, в частности, рибосомы, ДНК). Иммуногенные фракции находятся у большинства бактерий в капсуле (микрокапсуле) и клеточной стенке. Оказалось, что изолированные физическими способами клеточные структуры более иммуногенны, чем извлеченные химическими методами комплексы. В процессе химической экстракции более значительно повреждается исходная молекулярная организация биополимера, нарушается его нативная структура, в результате чего изменяются антигенные, в том числе иммуногенные свойства извлеченного комплекса. Внутриклеточные компоненты (цитоплазма, цитомембраны, генофор), где локализованы неспецифические антигены, обладают очень низкой иммуногенностью.
|
|
Помимо получения антигенов из отдельных анатомических структур часто возникает необходимость использования бактерий, как комплекса антигенов. Схема получения корпускулярного бактериального антигена: посев бактерий на плотную оптимальную питательную среду и культивирование в течение суток — смыв культуры физиологическим раствором — прогревание взвеси бактерии при температуре 60° С (для неспоровых бактерий) в течение 1 часа — стандартизация взвеси по стандартам мутности Государственного института стандартизации и контроля (ГИСК) медицинских биологических препаратов. Стандартизацию проводят оптическим методом, т. е. путем сравнения степени мутности взвеси бактерий с готовыми стандартами. Стандарты выпускаются густотой 500 млн., 1—1,5—2 млрд. микробных тел в 1 мл. Для определения густоты полученной взвеси 1 мл ее наливают в пустую пробирку, равную по диаметру со стандартом. Мерной пипеткой доливают физиологический раствор до тех пор, пока не исчезнет разница между густотой взвеси в этой пробирке и в стандарте на 1 млрд. Густота исходной взвеси бактерий выражается в млрд/мл и равна общему объему жидкости в рабочей пробирке. Исходную взвесь разводят до нужной концентрации бактерий. Определение количества бактерий во взвеси проводится также и нефелометрическим методом. В его основе лежит определение светорассеяния (мутности), вызываемого суспензией микробов. Количество света, рассеиваемое этой суспензией, пропорционально числу и размерам клеток при данной длине волны. Разность интенсивности света, падающего на кювету с микробной взвесью и прошедшего через него, по калибровочной кривой переводится в абсолютное количество бактерий. Данный метод может быть использован только для тех микробов, которые в жидких средах дают равномерное помутнение. а сама среда должна быть оптически прозрачной. Другие виды микроорганизмов (риккетсии, микоплазмы, грибки, простейшие, вирусы) имеют свои особенности антигенного состава, но общая характеристика свойств их антигенов остается той же, что и у бактерий (макромолекулярность, наличие антигенных детерминант и т. д.). С целью создания приобретенного искусственного активного иммунитета (человеку) или с целью получения сывороток (животному) вводят антигены (иммуногены) в очищенном виде, в составе убитых или живых микроорганизмов. Это введение редко бывает однократным, а чаще двух- или трех- и многократным по специальным схемам. Для получения сывороток и иммуноглобулинов от животных применяются схемы введения антигенов, в которых предусмотрены дозы, кратность, интервалы между введениями, метод введения (схемы гипериммунизации), а также возможность использования одного из адъювантов.
Адъювантами называют группу веществ как антигенной, так и неантигенной природы, относящихся к различным химическим соединениям и имеющим различное происхождение, которые при введении совместного с антигеном в организм животных и человека оказывают неспецифическое стимулирующее действие на формирование иммунного ответа. К ним относятся вещества неорганической природы: минеральные коллоиды (гидрат окиси алюминия, фосфат кальция, гидрат окиси железа), растворимые соединения (алюмо-калиевые квасцы, хлористый кальций); вещества органической природы: белки (протамины, желатин), липиды (животные, растительные масла и жиры), углеводы (крахмал, танин, пектиновые вещества), сложные вещества (адъювант Фрейнда, комплексы липидов с минеральными сорбентами). Наиболее полно действие адъювантов выявляется при первом соприкосновении организма с антигеном (грундиммунизация), но при последующих инъекциях антигена с адъювантом его стимулирующее действие заметно снижается.