Нагрузочные реакции агглютинации, их модификации. Реакция Кумбса

Феномен агглютинации заключается в способности АТ (агглютининов) связываться с корпускулярными АГ (агглютиногенами), склеивая их в агрегаты (агглютинаты), которые выпадают в осадок в присутствии электролита.

           Механизм реакции агглютинации описывается теорией «решетки», согласно которой агглютинат образуется при соединении одного активного центра 2-х валентного антитела с детерминантной группой АГ, а второго активного центра – с детерминантной группой другого АГ.Различают прямую и непрямую (пассивную) реакции агглютинации. Антигеном в прямой реакции агглютинации могут быть микробные клетки, эритроциты, лейкоциты.

Непрямые (пассивные) реакции агглютинации. Для данной реакции растворимые антигены или антитела адсорбируют на корпускулярном носителе, которым служат инертные частицы (латекс, бентонит, активированный уголь и другие) или клетки, например, эритроциты (бараньи, О- группы человека). Пассивные реакции агглютинации по чувствительности намного превосходят прямую реакцию агглютинации.

           Если адсорбентом являются эритроциты, реакция носит название пассивной (непрямой) гемагглютинации – РПГА или (РНГА). Реакцию обычно проводят с использованием пластмассовых пластин с лунками. Нагруженные (сенсибилизированные) эритроциты склеиваются в присутствии специфического искомого антигена или антитела и выпадают в осадок в виде гемагглютината в форме «зонтика». При отрицательной реакции сенсибилизированные эритроциты выпадают в осадок в виде «пуговки». Для идентификации возбудителей инфекционных болезней широко используется реакция коагглютинации. Для нее необходимы коагглютинирующие реагенты (Ко -А реагент). Они представляют собой взвесь золотистых стафилококков (S. aureus) штамма Cowan, на А белке которых нагружены Fc фрагментом Ат к искомым Аг. 

           Реакцию коагглютинации ставят на стекле капельным методом.

           РПГА. Реакцию используют либо для выявления специфических антител в сыворотке больного при серодиагностике, либо для идентификации неизвестного возбудителя или индикации его антигенов в исследуемом патологическом материале. Соответственно используют стандартные (коммерческие) эритроцитарные диагностикумы или суспензионные антитела, полученные путем сенсибилизации обработанных танином (танизированных) эритроцитов антителами. В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные разведения сыворотки больного, ориентируясь на диагностический титр. Затем в каждую лунку вносят одинаковый объем (0,05 мл) 3% суспензии нагруженных антигеном эритроцитов — соответствующего эритроцитарного диагностикума. Через 2 ч инкубации при 37°С учитывают результат, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): отрицательная реакция — осадок эритроцитов в виде компактного диска или колечка с ровными краями на дне лунки, положительная реакция — характерный кружевной вид осадка эритроцитов, тонкая пленка с неровными краями.

Реакция Кумбса. Неполные антитела в отличие от нормальных моновалентны, поскольку они имеют один активный центр, способный взаимодействовать только с одним эпитопом: в то время как другие эпитопы остаются не связанными. В результате этого не происходит образования крупных комплексов, выпадающих в осадок в растворе электролита. Последние проявляются только в реакциях с бивалентными антителами. Для исправления этого положения вводится антиглобулиновая сыворотка (АГС), содержащая бивалентные антитела к глобулину, которая свяжет между собой моновалентные антитела, содержащиеся в исследуемом материале Таким образом произойдет визуально видимая реакция гемагглютинации или агглютинация, свидетельствующая о наличии в исследуемой сыворотке неполных (моновалентных) антител. Например, в случае беременности резус-отрицательной женщины резус-положительным плодом у нее в сыворотке крови появятся неполные антитела. Для их выявления в пробирку с исследуемой сывороткой крови вносят резус-положительные эритроциты, а затем АГС. Появление гемагглютинации свидетельствует о положительной реакции.

РСК. Ингредиенты, механизм. Практическое применение.

Данная реакция используется для серодиагностики и обнаружения антигена в исследуемом материале, сероидентификации выделенных культур. Комплемент связывается с Fc-фрагментом антител независимо от их специфичности. Способность комплемента связываться только с комплексом антиген — антитело за счет Fc-фрагментов последнего и не вызывать гемолиз сенсибилизированных эритроцитов (тест-система) послужила основой для широкого применения РСК в лабораторной практике в течение прошедшего столетия. Комплемент= используют сыворотку крови морской свинки с установкой рабочей дозы. В пробирку вносят сыворотку крови, АГ и рабочую дозу комплемента. Инкубируют. Регистрация-по гемолизу эритроцитов барана. Когда комплемент не связывается с исследуемой системой антиген — антитело, т.е. остается свободным, наблюдается полный гемолиз бараньих эритроцитов, который свидетельствует об отрицательной реакции. Отсутствие гемолиза указывает на связывание комплемента системой антиген — антитело, т.е. на положительную реакцию, которая обозначается крестами. Интенсивность задержки гемолиза оценивается по четырехкрестной системе, при этом полное отсутствие гемолиза обозначается ++++.

Для реакции необходимы:

ñ Антиген - микробы, эритроциты или другие клетки.

ñ Антитело (лизин) - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного. Бактериолитическая сыворотка содержит антитела, участвующие в лизисе бактерий; гемолитическая - гемолизины, способствующие лизису эритроцитов; для лизиса спирохет нужны спирохетолизины, клеток - итолизины и т. д.

ñ Комплемент. Больше всего комплемента в сыворотке морских свинок.

ñ Изотонический раствор.