Применение IT для проведения молекулярно-генетических исследований

Часто для получения необходимой информации бывает не достаточно воспользоваться вышеуказанными поисковыми системами. Например, необходимо найти последовательность нуклеотидов определенного гена, подобрать праймеры к заданной нуклеотидной последовательности. Сравнение аминокислотных и нуклеотидных последовательностей является важным звеном исследований молекулярной генетике, которое позволяет идентифицировать семейства генов, относить к ним секвенированные последовательности, устанавливать их структурные и функциональные взаимоотношения. В настоящее время, когда секвенируются целые геномы, значение подобных исследований постоянно возрастает. В таких случаях используют специальные программы.

К программам, используемым для сравнения последовательностей с последующим определением их сходства, относятся: ALIGN, AMAS, BLAST, BLAT, CLUSTAL, DiAlign, FASTA, HI, HMMER, MAP, MGA, OWEN, PipMaker, MultiPipMaker, T-Coffee и др. Наиболее часто используются программы CLUSTAL и BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, основное средство поиска, основанное на локальных выравниваниях).

BLAST (англ. Basic Local Alignment Search Tool) — семейство компьютерных программ, служащих для поиска гомологов белков или нуклеиновых кислот, для которых известна первичная структура (последовательность) или её фрагмент. Используя BLAST, исследователь может сравнить имеющуюся у него последовательность с последовательностями из базы данных и найти последовательности предполагаемых гомологов. Является важнейшим инструментом для молекулярных биологов, генетиков, биоинформатиков, систематиков. Первое поколение BLAST программ появилось в начале 90-х годов прошлого столетия. Второе поколение программ данной серии представлено двумя вариантами: WU-BLAST 2 (Washington University BLAST 2) и NCBI BLAST 2 (National Center for Biotechnology information BLAST 2). Эти программы являются самыми быстрыми (скорость поиска на порядок выше программы FASTP и других алгоритмов) и чувствительными (определяют даже незначительное сходство последовательностей). Программы серии BLAST продолжают модифицироваться, при этом скорость поиска у последних версий BLAST приблизительно в 3 раза выше скорости оригинала.

Семейство программ серии BLAST делится на 5 основных групп:

1. Нуклеотидные – предназначены для сравнения изучаемой нуклеотидной последовательности с базой данных секвенированных нуклеиновых кислот и их участков:

1.1. megablast – быстрое сравнение с целью поиска высоко сходных последовательностей,

1.2.  dmegablast – быстрое сравнение с целью поиска дивергировавших последовательностей, обладающих незначительным сходством,

1.3. blastn – медленное сравнение с целью поиска всех сходных последовательностей и др..

2. Белковые – предназначены для сравнения изучаемой аминокислотной последовательности белка с имеющейся базой данных белков и их участков.

2.1.  blastp – медленное сравнение с целью поиска всех сходных последовательностей,

2.2.  cdart – сравнение с целью поиска гомологичных белков по доменной архитектуре,

2.3.  rpsblast – сравнение с базой данных консервативных доменов,

2.4.  psi-blast – сравнение с целью поиска последовательностей, обладающих незначительным сходством,

2.5. phi-blast – поиск белков, содержащих определенный пользователем паттерн и др.

3. Транслирующие – способны транслировать нуклеотидные последовательности в аминокислотные:

3.1. blastx – переводит изучаемую нуклеотидную последовательность в кодируемые аминокислоты, а затем сравнивает ее с имеющейся базой данных аминокислотных последовательностей белков,

3.2. tblastn – изучаемая аминокислотная последовательность сравнивается с транслированными последовательностями базы данных секвенированных нуклеиновых кислот,

3.3. tblastx – переводит изучаемую нуклеотидную последовательность в аминокислотную, а затем сравнивает ее с транслированными последовательностями базы данных секвенированных нуклеиновых кислот.

4. Геномные – предназначены для сравнения изучаемой нуклеотидной последовательности с базой данных секвенированного генома какого-либо организма (человека, мыши и др.)

5. Специальные – прикладные программы, использующие BLAST:

5.1. bl2seq – сопоставление двух последовательностей по принципу локальных выравниваний,

5.2. VecScreen – определение сегментов нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты, которые могут иметь векторное происхождение и др.

Все выравнивания принято делить на глобальные (последовательности сравниваются полностью) и локальные (сравниваются только определенные участки последовательностей). Программы серии BLAST производят локальные выравнивания, что связано с наличием в различных белках сходных доменов и паттернов. Кроме этого локальное выравнивание позволяет сравнить иРНК с геномной ДНК. В случае глобального выравнивания обнаруживается меньшее сходство последовательностей, особенно их доменов и паттернов.

После введения изучаемой нуклеотидной или аминокислотной последовательности (запрос) на одну из web-страниц BLAST, она вместе с другой входной информацией (база данных, размера «слова» (участка), значение величины E и др.) поступает на сервер. BLAST создает таблицу всех «слов» (в белке – это участок последовательностей, который по умолчанию состоит из трех аминокислот, а для нуклеиновых кислот из 11 нуклеотидов) и сходных «слов». Затем в базе данных проводится их поиск. Когда обнаруживается соответствие, то делается попытка продлить размеры «слова» (до 4 и более аминокислот и 12 и более нуклеотидов) сначала без гэпов (пробелов), а затем с их использованием. После максимального продления размеров всех возможных «слов» изучаемой последовательности, определяются выравнивания с максимальным количеством совпадений для каждой пары запрос – последовательность базы данных, и полученная информация фиксируется в структуре SeqAlign. Форматер, расположенный на сервере BLAST, использует информацию из SeqAlign и представляет ее различными способами (традиционным, графическим, в виде таблицы).

Для каждой обнаруженной в базе данных программами BLAST последовательности необходимо определить, насколько она сходна с изучаемой последовательностью (запрос) и значимо ли это сходство. Для этого BLAST вычисляет число битов и величину Е (expected value, E-value) для каждой пары последовательностей.

При определении сходства ключевым элементом является матрица замен, так как она определяет показатели сходства для любой возможной пары нуклеотидов или аминокислот. В большинстве программ серии BLAST используется матрица BLOSUM62 (Blocks Substitution matrix 62% identity, блоковая матрица замен с 62% идентичности). Исключением являются blastn и megablast (программы, которые выполняют нуклеотид – нуклеотидные сравнения и не используют матрицы аминокислотных замен).

С помощью модифицированных алгоритмов Смита-Уотермана или Селлерса определяются все пары сегментов (продленные «слова»), которые нельзя увеличить, так как это приведет к уменьшению показателей сходства. Такие пары продленных «слов» называются парами сегментов с максимальным сходством (high-scoring segment pairs, HSP). В случае достаточно большой длины изучаемой последовательностей (m) и последовательности базы данных (n) показатели сходства HSP характеризуются двумя параметрами K (размера области поиска) и? (системы подсчета). Эти показатели необходимо указывать при приведении показателей сходства изучаемой последовательности и последовательности базы данных (S).

Для сравнения показателей сходства различных выравниваний независимо от используемой матрицы, их необходимо преобразовать. Для получения преобразованного показателя сходства (числа битов, Sґ) используют формулу:

Sґ = (?S – ln K)/ln 2 (1).

Величина Sґ показывает, насколько сходны последовательности (чем больше число битов, тем больше сходство). Так как в формулу расчета Sґ заложены показатели К и?, то нет необходимости указывать их при приведении значений Sґ. Величина E (Е-value), соответствующая показателю Sґ, показывает достоверность данного выравнивания (чем ниже значение E, тем достовернее выравнивание). Она определяется по формуле:

E = mn 2 – Sґ (2).

Программы BLAST преимущественно определяют значение E, а не P (вероятности наличия хотя бы одного HPS с показателем, превышающим или равным S). Но при E < 0,01 значения P и E почти идентичны.

Величина E определяется по формуле (2) при сравнении лишь двух аминокислотных или нуклеотидных последовательностей. Сравнение изучаемой последовательности длиной m с множеством последовательностей базы данных может основываться на двух положениях. Первое положение состоит в том, что все последовательности базы данных одинаково сходны с изучаемой. Это подразумевает, что значение E для выравнивания с короткой последовательностью, содержащейся в базе данных, следует приравнять со значением E для выравнивания с длинной последовательностью. Для вычисления значения E по базе данных необходимо умножить значение E, полученное при попарном сравнении, на число последовательностей в ней. Второе положение заключается в том, что изучаемая последовательность более сходна с короткими, а не с длинными последовательностями, потому что последние часто состоят из различных участков (многие белки состоят из доменов). Если предположить, что вероятность сходства пропорциональна длине последовательности, то попарное значение E для последовательности базы данных длиной n надо умножить на N/n, где N – общая длина аминокислот или нуклеотидов в базе данных. Программы BLAST преимущественно используют этот подход для вычисления значений E по базе данных.

Теоретически локальное выравнивание может начинаться с любой пары нуклеотидов или аминокислот выровненных последовательностей. Однако HPS, как правило, не начинаются близко к краю (началу или концу) последовательностей. Для коррекции такого краевого эффекта необходимо вычислять эффективную длину последовательностей. В случае последовательностей длиной более 200 остатков происходит нейтрализация краевого эффекта.

Рассмотренные выше показатели разрабатывались для не содержащих гэпов местных выравниваний. Однако в ходе последующих исследований было установлено, что эти показатели могут использоваться и для выравниваний, содержащих гэпы.

При подборе последовательностей праймеров для постановки ПЦР-анализа часто пользуются программой OligoСalc. Для анализа в окно браузера копируют смоделированную нуклеотидную последовательность, указывая 5’ и 3’-концы, затем нажимают на панель Calculate. В появившемся окне содержится вся информация о данном праймере:длинна, число Г-Ц пар, температура плавления. Для анализа самокомплементарности и наличия шпилечных структур в браузере необходимо нажать на панель Check Self-complementarity. В появившемся окне содержится информация о наличии и числе двунитевых участков и шпилек.