Результаты и обсуждение

2.1. Изучение белковых последовательностей простаноидных рецепторов.

2.1.1. Средняя частота встречаемости аминокислотных остатков в EP4-рецепторе человека, всех PG-рецепторах человека и вообще всех белках человека представлена в таблице 1.

 

Таблица 1.

Средняя частота встречаемости аминокислотных остатков в EP4-рецепторе человека, всех PG-рецепторах человека и вообще всех белках человека

 

	Частота встречаемости а/к, %
А/к	в pe24_human	в PG-рецепторах человека	в белках человека
L	12,7	14,6	9,8
S	12,1	9,8	7,9
A	7,8	10,2	7,1
V	7,2	7,0	6,2
G	6,8	7,2	6,8
R	6,6	7,1	5,5
T	5,9	5,2	5,3
I	5,7	4,2	4,4
P	4,9	4,9	1,6
F	3,9	4,9	3,8
E	3,9	2,9	7,0
Q	3,5	3,2	4,6
D	3,1	2,2	4,9
N	2,9	2,4	3,7
Y	2,9	2,3	2,8
C	2,7	3,4	2,3
K	2,7	2,1	5,7
M	2,3	2,8	2,2
H	1,8	1,9	2,5
W	0,8	1,8	1,2
U	0,0	0,0	0,0

Из приведенных данных видно, что и в PG-рецепторах, и во всех белках человека наиболее часто встречаются 3 аминокислоты: лейцин, серин и аланин. Их частоты для EP4-рецептора и для PG-рецепторов (лейцина — 12,7 % и 14,6 %, серина — 12,1 % и 9,8 %, аланина — 7,8 % и 10,2 %, соответственно) заметно превышают среднестатистические для человека (9,8 %, 7,9 % и 7,1 %).

Если бы все аминокислоты встречались одинаково часто, доля каждой из них была бы равна 4,8 %. В EP4-рецепторе человека с частотой, большей этого значения, встречаются лейцин, серин, аланин, валин, глицин, аргинин, треонин, изолейцин и пролин (перечислены в порядке убывания частоты). Во всех PG-рецепторах человека с частотой, превышающей это значение, встречаются те же аминокислоты, за исключением изолейцина, и фенилаланин. Среднестатистические же результаты для всех белков человека показывают, что частота, большая, чем 4,8 %, характерна для всех вышеназванных аминокислот, за исключением изолейцина и фенилаланина, а также для глутаминовой кислоты, лизина и аспарагиновой кислоты.

Глутаминовая кислота, лизин и аспарагиновая кислота — гидрофильные аминокислоты, а изолейцин и фенилаланин — гидрофобные. Из трех наиболее частых аминокислот лейцин и аланин — также гидрофобные. То есть количество гидрофильных аминокислотных остатков в PG-рецепторах (трансмембранных белках), как и ожидалось, меньше среднестатистического; а количество гидрофобных — больше.

 

2.1.2. Для выявления консервативных участков в белковых последовательностях PG-рецепторов проведено их множественное выравнивание.

Множественное выравнивание сделано для близких гомологов EP3-рецептора человека. Для этого с помощью программы BLAST получен список из 34 белков; все они принадлежат млекопитающим (человек, обезьяна, собака, мышь, крыса, кролик, бык и свинья). E Value для этих белков — не более 2*10 –15; остальные белки, предложенные программой BLAST в качестве возможных гомологов, имели E Value не менее 4*10 –5. В число этих 34 белков входят все PG-рецепторы, лежащие в SwissProt (и только они). Проведено выравнивание их аминокислотных последовательностей.

Сравнение сделанного автоматически выравнивания с представленным в базе данных показало, что результаты значительно различаются (в выравнивании, выставленном в Интернете, больше консервативных аминокислотных остатков). От сведений, приведенных в статье [2], оно также отличалось меньшим чилом консервативных аминокислотных остатков. А авторы статьи [9] предупреждали, что автоматические программы плохо справляются с выравниванием большого числа трансмембранных белков. Поэтому было проведено редактирование выравнивания вручную в программе GeneDoc.

Мутации в трансмембранных участках (α-спиралях) менее вероятны, чем во вне- или внутриклеточных участках, поэтому при выравнивании трансмембранных белков стоит опираться прежде всего на консервативные аминокислоты в α-спиралях как на более достоверные. В основе редактирования лежал поиск мотивов, приведенных в статье [10], которые встречаются у большинства представителей семейства родопсиновых рецепторов (так называемых “отпечатков пальцев” — fingerprints):

· G₇₂N₁₀₀ — в 1-ом трансмембранном участке;

· L₉₂XXXD₉₁ — во 2-ом трансмембранном участке;

· C₉₄(17X)L₇₉(5X)D₈₀R₉₈Y₇₄ — в 3-ем трансмембранном участке и начале 2-ой внутриклеточной петли;

· W₈₆ — в 4-ом трансмембранном участке;

· F₄₉XXP₇₇(7X)Y₈₉ — в 5-ом трансмембранном участке;

· F₈₀XXC₇₆W₅₈XP₇₃ — в 6-ом трансмембранном участке и

· N₈₆P₉₇ — в 7-ом трансмембранном участке.

В этом списке нижние индексы — это проценты консервативности соответствующих аминокислотных остатков.

D во 2-ом трансмембранном участке, а также DRY (или ERW) в 3-ем трансмембранном участке и начале 2-ой внутриклеточной петли важны для активации рецептора. Они консервативны для всего семейства А и не консервативны для других семейств G-белок-связывающих рецепторов. Это позволяет считать, что изменение конформации центрального домена или процессы, приводящие к данному изменению конформации, различны для разных семейств [4].

Не все вышеперечисленные мотивы встречались у PG-рецепторов точно в таком виде. Непосредственно для PG-рецепторов абсолютно консервативными мотивами являются следующие:

· GXXXNXXA — в 1-ом трансмембранном участке;

· LXXXDXXG — во 2-ом трансмембранном участке;

· L(8X)MXXE — в 3-ем трансмембранном участке;

· LP — в 4-ом трансмембранном участке;

· N(6X)L — в 5-ом трансмембранном участке;

· CXXP — в 6-ом трансмембранном участке и

· R(6X)IXDPW(5X)R — в 7-ом трансмембранном участке.

После такого редактирования число консервативных аминокислотных остатков увеличилось до 27. Они расположены

· во всех 7 трансмембранных участках;

· в 1-ой внутриклеточной петле;

· в 1-ой внеклеточной петле;

· во 2-ой внутриклеточной петле;

· во 2-ой внеклеточной петле;

· в 4 внутриклеточном участке.

Консервативные аминокислотные остатки показаны на рис. 1.

2.1.3. Сравнение последовательностей PG- рецепторов человека путем их множественного выравнивания с последующим ручным редактированием показало, что консервативными являются 28 аминокислотных остатков. Они отмечены на рис. 1. Это те же аминокислотные остатки, что и в предыдущем пункте, а также треонин-64 (выделен на рис. 1 серым цветом).

 

2.1.4. Сравнение последовательностей EP-рецепторов у млекопитающих путем их множественного выравнивания с последующим ручным редактированием показало, что консервативными являются 40 аминокислотных остатков (рис. 2). В их число входят все аминокислотные остатки, консервативные для PG-рецепторов.

 

2.1.5. Для выявления общих черт в строении более далеких гомологов PG-рецепторов проведено сравнение последовательностей типичных представителей семейства G-белок-связывающих рецепторов.

С помощью программы PSI-BLAST получен список белков — более далеких гомологов EP3-рецептора человека. Для построения выравнивания и филогенетического древа из него взяты первые 100 белков (E Value меньше 10 -66). Все они являются представителями класса А G-белок-связывающих рецепторов. Эти белки принадлежат уже не только млекопитающим (список белков и организмов, а также множественное выравнивание см. в Интернете, http://kodomo.cmm.msu.ru/~venel/index.html). Стоит отметить, что из всех простаноидных рецепторов в эти 100 белков не вошли DP-рецепторы, EP1-рецепторы и EP3-рецептор овцы.

Множественное выравнивание этих белков так же, как и в пункте 2.2, значительно отличалось от результатов, представленных в базе данных и статье [2] (изначально оно содержало только 1 консервативную аминокислоту — цистеин-91). Поэтому оно тоже было отредактировано вручную (путем поиска мотивов, указанных в статье [10]), после чего число консервативных аминокислот в нем стало равно 6 (рис. 3).

 

2.1.6. По результатам проведенных выравниваний построены филогенетические деревья. При этом последовательность EP3-рецептора овцы была удалена, так как она содержит только 2 трансмембранных участка: 4-ый и 5-ый. Присутствие в выравнивании такой короткой последовательности сильно осложнило бы работу программы, строящей деревья, и могло бы привести к искаженным результатам.

Филогенетическое древо PG-рецепторов (рис. 4) показывает, что эти белки в соответствии со степенью сходства их последовательностей можно разделить на 2 группы:

1) EP2-, EP4-, PD- и PI-рецепторы и

2) EP1-, EP3-, PF- и TA-рецепторы.

Внутри каждой из групп видно деление на более мелкие группы, в каждую из которых входят рецепторы одного конкретного типа. То есть рецепторы одного типа, встречающиеся у разных животных, более близки друг к другу, чем разные рецепторы, принадлежащие одному организму.

Филогенетические деревья для EP-рецепторов (рис. 5) и 100 представителей семейства родопсиновых рецепторов так же показывают, что рецепторы одного типа, встречающиеся у разных животных, более близки друг к другу, чем разные рецепторы, принадлежащие одному организму. Для большей наглядности второе древо сокращено до 47 белков (каждый вид белка представлен не более 2 раз — из 2 разных животных); оно выставлено в Интернете (http://kodomo.cmm.msu.ru/~venel/rhodfam_tree.html).

 

Все вышесказанное позволяет предположить, что создание высокоселективных агонистов или антагонистов к какому-либо одному виду PG-рецепторов является осуществимой задачей. Также можно предположить, что эти агонисты/антагонисты будут одинаково действенны для данного вида рецептора, вне зависимости от вида животного. Это значит, что при разработке лекарств для человека можно будет проводить исследования на других животных (мышах, крысах).