Генная терапия ex vivo

Генная терапия ex vivo, как правило, включает следующие этапы.

1. Получение клеток от больного.

2. Исправление генетического дефекта с помощью переноса нужного гена в изолированные клетки.

3. Отбор и наращивание генетически «исправленных» клеток.

4. Инфузия или трансплантация этих клеток пациенту.

Использование собственных клеток пациента (аутологичных клеток) гарантирует, что после инфузии или трансплантации у него не разовьется иммунный ответ.

Прямая генная терапия (in vivo): основана на прямом введении терапевтических генов (с помощью векторных систем) в стенку сосуда, миокард или скелетные мышцы.

Для введения генов в клетки-мишени сосудов используют оба подхода, но значительно чаще применяют прямую методику. Кроме выбора потенциально терапевтических генов успех лечения зависит от характеристик специальных генных носителей (векторных систем / векторов) и от средств механической доставки векторов к клеткам-мишеням.

Невирусные векторы представлены либо плазмидной ДНК, либо комплексами ДНК с липосомами, аденовирусными белками, трансферрином, полилизином и т.д. Плазмидная ДНК не встраивается в геном хозяина и обеспечивает лишь 2 – 4-недельную экспрессию гена. Кроме того, трансфекция клеток плазмидной ДНК in vivo составляет всего 0,1 %, и поэтому метод используют при необходимости некоторое время секретировать белок, способный по паракринному механизму действовать на другие клетки. Если же требуется длительная экспрессия белка, активного только в той клетке, где он синтезирован, используют модификации вектора. Так, для повышения трансфекции клеток сосудов in vivo до 4 – 5 % применяют липосомальный плазмидный вектор, при этом положительный заряд обволакивающих ДНК липидных пузырьков способствует проникновению ДНК через отрицательно заряженную мембрану клетки-мишени.

Вирусные векторы представлены ослабленными или модифицированными ретровирусами, аденовирусами, аденоассоциированными вирусами, вирусом герпеса 1-го типа, лентивирусами и т.д. Ретровирусные векторы применяются только для сосудистой генной терапии ex vivo, а неиспользование in vivo обусловлено их недостатками. Аденовирусныевекторные системы в сотни и тысячи раз эффективнее, чем плазмидные и ретровирусные, но обеспечивают лишь кратковременную экспрессию введенных генов (до 4 недель), а повторные введения чреваты развитием воспалительных и иммунных реакций, особенно в случае 1-го поколения аденовирусов. Развитие иммунного ответа на вирусные белки может сопровождаться элиминацией внесенных терапевтических генов. Лентивирусы (ВИЧ) также способны к трансфекции неделящихся клеток, но они потенциально опасны для человека. Эффективен и перенос генов с помощью гемагглютинирующих вирусов, но применение этого вектора ограничено неспецифическим связыванием вирусов с эритроцитами. Перспективно использование аденоассоциированных вирусов — непатогенных, способных к трансфекции неделящихся клеток и обеспечению длительной экспрессии введенных терапевтических генов.

 

36. Дайте определение генной терапии ex vivo, опишите ее этапы; укажите преимущества неаутологичной генной терапии ex vivo и способ защиты трансдуцированных неаутологичных клеток от иммунного ответа.

ЭТО ДЛЯ ОБЩЕГО РАЗВИТИЯ: Генной терапией называется генетическая инженерия соматических клеток человека, направленная на исправление генетического дефекта, вызывающего заболевание. Коррекция специфического заболевания осуществляется путем введения в дефектные соматические клетки нормальных экспрессирующихся генов. К настоящему времени все подходы к генной терапии соматических клеток можно разделить на две категории: терапия ex vivo(А) и in vivo(Б)

Генная терапия ex vivo предполагает генетическое исправление дефектных клеток вне организма с последующим возвращением нормально функционирующих клеток в организм.

Генная терапия in vivo предусматривает доставку терапевтического гена непосредственно в клетки определенной ткани пациента.

Генная терапия ex vivo включает следующие этапы:

1) получение дефектных клеток больного и их культивирование;

2) перенос нужного гена в изолированные клетки с помощью трансфекции терапевтической генной конструкции;

3) отбор и наращивание генетически исправленных клеток;

4) трансплантация или трансфузия этих клеток пациенту.

Использование собственных клеток пациента гарантирует, что после их возвращения у него не разовьется иммунный ответ. Процедура переноса генной конструкции должна быть эффективной, а нормальный ген должен стабильно поддерживаться и непрерывно экспрессироваться.

Ex vivo означает «то, что происходит вне организма», то есть проведение экспериментов в живой ткани, перенесённой из организма в искусственную внешнюю среду. Наиболее распространённая техника ex vivo использует живые клетки или ткани, извлечённые из живого организма и выращенные (сохранённые) в стерильных лабораторных условиях в течение нескольких дней или недель. Такие клетки служат образцами поведения организма в целом, как следствие — сокращается потребность в экспериментах над животными и человеком.

Генная терапия ex vivo, как правило, включает следующие этапы.

1. Получение клеток от больного.

2. Исправление генетического дефекта с помощью переноса нужного гена в изолированные клетки.

3. Отбор и наращивание генетически «исправленных» клеток.

4. Инфузия или трансплантация этих клеток пациенту.

Использование собственных клеток пациента (аутологичных клеток) гарантирует, что после инфузии или трансплантации у него не разовьется иммунный ответ. Необходимо, чтобы процедура переноса генов, используемая для генной терапии ex vivo, была эффективной, а «терапевтический» ген стабильно поддерживался и непрерывно экспрессировался. Этим условиям отвечают векторы, полученные на основе мышиных ретровирусов. Но ретровирусы имеют существенный недостаток — они могут приводить к злокачественной транформации клеток. Такую вероятность необходимо уменьшить, а лучше полностью исключить. Генная терапия ex vivo основана на трансплантации генетически модифицированных клеток, производящих терапевтический белок. Использование собственных клеток пациента предотвращает их отторжение, но ограничивает сферу применения генной терапии ex vivo. Так, число клеток ткани-мишени может быть недостаточно для их извлечения и культивирования in vitro, некоторые соматические клетки неэффективно поглощают ДНК, а экспрессия клонированного гена иногда оказывается временной. Поэтому в настоящее время разрабатывают системы, которые защищают неаутологичные (ксеногенные, аллогенные) клетки от иммунного ответа и позволяют высвобождать «терапевтический» белок. Неаутологичная генная терапия ex vivo включает выделение тканеспецифичных клеток, хорошо растущих в культуре (например, фибробластов или кератиноцитов кожи, астроцитов мозга, гепатоцитов или миобластов), и их генетическую модификацию с помощью «терапевтического» гена. Рекомбинантные клетки заключают в искусственную полупроницаемую полимерную мембрану, через которую выходит рекомбинантный белок и поступают в клетки питательные вещества. Мембрана неиммуногенна и не вызывает сенсибилизации пациента и отторжения имплантированных клеток. В качестве инкапсулирующего материала используют разные полимеры: альгинат—поли- L-лизин—альгинат, полиэфирсульфон, полиакрилонитрилковинилхлорид. Доклинические испытания, проведенные in vitro и на модельных животных, показали, что инкапсулированные рекомбинантные клетки могут пролиферировать и длительное время производить большие количества рекомбинантного белка.

37. Объясните схему получения упакованного ретровирусного вектора при помощи «пакующей клеточной линии»; укажите, в чем преимущество данного подхода по сравнению с прямым использованием ДНК ретровирусного вектора для трансформации клеток в ходе генной терапии ex vivo.

Геном ретровируса дикого типа представлен двумя идентичными одноцепочечными молекулами РНК, каждая из которых состоит из шести участков: длинного концевого повтора; некодируюшей последовательности пси+ (у+), необходимой для упаковки РНК в вирусную частицу; трех генов, кодирующих структурный белок внутреннего капсида (gag), белок, обладающий функциями обратной транскриптазы и интегразы (pol), и белок оболочки (env)\ 3'-LTR-последовательности. Жизненный цикл ретровируса включает следующие стадии:

1. Инфицирование клетки-мишени.

2. Синтез ДНК-копии генома с помощью собственной обратной транскриптазы.

3. Транспорт вирусной ДНК в ядро.

4. Встраивание вирусной ДНК в один из хромосомных сайтов клетки-хозяина.

5. Транскрипцию мРНК с вирусной ДНК под контролем сильного промотора, локализованного в 5'-LTR.

6. Трансляцию белков Gag, Pol и Env в цитоплазме.

7. Образование вирусного капсида и упаковку в него двух РНК-цепей и молекул обратной

транскриптазы.

8. Высвобождение вирионов из клетки.

Для получения ретровирусного вектора полноразмерную ДНК ретровируса встраивают в плазмиду, с помощью эндонуклеазного расщепления удаляют большую часть гена gag и гены pol и env, оставляя 5'-концевой участок гена gag и 5'- и З'-LTR, а затем рядом с у'-областью встраивают «терапевтический» ген, транскрипция которого будет контролироваться 5'-LTR-np0M0тором; при необходимости можно встроить и маркерный селективный ген с собственным промотором. Такая конструкция позволяет экспрессировать оба клонированных гена. На основе этой схемы созданы различные ретровирусные векторы. Максимальный размер ДНК-вставки, которую может переносить ретровирусный вектор, — примерно 8 т. п. н.

Ключевые моменты генной терапии — адресная доставка «терапевтического» гена и обеспечение его экспрессии в определенных клетках или тканях. Сначала в качестве основного средства доставки «терапевтических» генов рассматривали векторы, полученные на основе вирусов человека. Это было связано с наличием у них механизмов проникновения в специфические клетки. Наиболее многообещающими считали векторы на основе ретровирусов. Но нативный ретровирус — это инфекционный агент, который повреждает клетки и нередко приводит к их злокачественной трансформации. Наиболее значимым достижением на пути практической реализации генной терапии стала разработка системы для упаковки «терапевтических» генов в инфекционные вирусные частицы, сохранившие способность прикрепляться к клеткам-хозяевам. Манн и др. сконструировали первую клеточную линию для упаковки ретровирусов. Для этого они встроили вирусный геном с предварительно удаленной нуклеотидной последовательностью, ответственной за упаковку, в хромосому клеточной линии, которая в этих условиях производит неинфекционные вирусные частицы. После трансфекции этих клеток ДНК- конструкцией, которая содержала последовательность, необходимую для упаковки, и терапевтический ген, но не содержала ретровирусные гены, она упаковывалась в вирусные частицы, которые затем использовали для доставки «терапевтического» гена в нужные клетки. Этот подход был принят на вооружение другими исследователями, занимающимися генной терапией. Спустя несколько лет исходную «пакующую» клеточную линию адаптировали и для других вирусных векторов. В 1985 г., имея в виду результаты Манна и др., У. Андерсон отметил: «В последнее время появились эффективные системы доставки—экспрессии, которые позволяют сделать генную терапию реальностью». А 22 мая 1989 г. Андерсон и его коллеги начали первое клиническое испытание по генной терапии. Предпринимавшиеся до недавнего времени попытки генной терапии не отличались особым успехом, но полученная информация свидетельствует о том, что в будущем она станет вполне обычным методом лечения многих заболеваний.

Опишите схему генной активации предшественника лекарственного вещества при помощи терапевтической системы GCV-HSVtk (ганцикловир - ген тимидинкиназы), предназначенной для уничтожения быстроделящихся раковых клеток.

Несмотря на широкое применение хирургических методов лечения, лучевой и химиотерапии, злокачественные новообразования по-прежнему остаются одной из основных причин смерти людей, поэтому задача разработки новых способов их лечения является весьма актуальной. Одним из таких способов является уничтожение пролиферирующих опухолевых клеток с помощью ганцикловира [GCV; 9-(1,3-дигидрокси-2-пропоксиметил)гуанина], активированного продукта гена тимидинкиназы вируса простого герпеса (HSV7&). Для этого проводят in vivo трансдукцию или трансфекцию опухолевых клеток геном HSV/&, находящимся под контролем активного промотора, а через несколько дней вводят ганцикловир. Вирусная тимидинкиназа фосфорилирует ганцикловир с образованием ганциктовирмонофосфата. Киназы клетки-хозяина почти не фосфорилируют ганцикловир, зато охотно присоединяют фосфатные группы к его монофосфату с образованием ганцикловиртрифосфата, который ингибирует ДНК-полимеразу и останавливает синтез ДНК, вызывая гибель пролиферирующих клеток. Кроме того, через межклеточные контакты ганцикловиртрифосфат может проникать в нетранссрицированные опухолевые клетки, приводя и к их гибели. Одна экспрессирующая ген HSV/A опухолевая клетка может уничтожить до 10 немодифициро-ванных клеток. Это явление называется «эффектом свидетеля». Ген, вызывающий при определенных условиях гибель собственной клетки, называют геном «самоубийства», а термин «пролекарство» относится к неактивной форме лекарственного вещества, которая активируется с помощью другого компонента терапевтической системы. Разработаны и другие комбинации «пролекарство» — ген-активатор, но система GCV— HSV/ft используется чаще других. Эффективность системы GCV— HSV7& доказана целым рядом доклинических испытаний. Однако I фаза ее клинических испытаний, в которых участвовали больные с терминальной стадией рака, не показала регресса опухоли. Возможно, ген HSV/A был трансдуцирован в слишком малое число опухолевых клеток и, несмотря на «эффект свидетеля», не мог подавить рост опухоли. В настоящее время разрабатываются новые подходы, которые смогут повысить частоту трансдукции и доставить ген HSVfft в клетки по всему объему опухоли. Для генной терапии рака разработаны также комбинированные подходы, использующие две разные системы генов. В одном из них сочетаются GCV— HSV^-терапия и генная иммунотерапия. Одну часть опухолевых клеток трансдуцируют геном HSVfft, другую — клонированной кДНК (или геном) одного из цитокинов. Показано, что опухолевые белки, которые высвобождаются из клетки, уничтоженной в результате терапии с помощью гена «самоубийства», взаимодействуют с иммунными клетками, привлекаемыми к месту локализации опухоли цитокином, и запускают противоопухолевую иммунную реакцию. Кроме того, противоопухолевые антитела, поступая в кровоток и циркулируя по всему организму, предотвращают появление метастазов. Этот подход к генной терапии рака был проверен экспериментально: в печень животных имплантировали клетки рака толстой кишки, раздельно трансдуцированные генами HSV/£ одного из цитокинов. Введение ганцикловира останавливало рост опухоли в печени. Опухоль не возникала и при введении нетрансдуцированных опухолевых клеток в другие ткани такого животного. У контрольных животных в аналогичных условиях происходило развитие опухолей во всех местах введения нетрансдуцированных клеток рака толстой кишки. Несмотря на столь многообещающие результаты, прежде чем приступать к клиническим испытаниям терапии с использованием гена «самоубийства» или различных комбинаций генной терапии, необходимо установить, какие опухоли будут поддаваться такому лечению и не вызовет ли но побочных эффектов.

39.  Опишите способ лечения злокачественных новообразований с помощью «комбинированного» подхода, сочетающего GCV— HSVtk-терапию и генную иммунотерапию.    

Ответ в 38

40.  Дайте определение генной терапии in vivo? Опишите этапы генной терапии in vivo?

Генная терапия in vivo предполагает доставку «терапевтического» гена непосредственно в клетки определенной ткани пациента. Ретровирусные векторы проникают только в делящиеся клетки-мишени, однако во многих тканях, на которые направлена генная терапия, большинство клеток не делится. Поэтому были разработаны разнообразные вирусные и невирусные векторные системы доставки «терапевтических» генов, учитывающие большое число потенциальных тканей-мишеней (кожа, мышцы, легкие, мозг, толстая кишка, селезенка, печень, клетки крови) и расположение их в организме человека. «Идеальная» система доставки должна обеспечивать высокую эффективность поглощения «терапевтического» гена клетками-мишенями, минимальность его внутриклеточного разрушения при транспорте в ядро и поддержание уровня экспрессии, достаточного для облегчения состояния больного.   Можно вставить сюда же ответ 41

41. Опишите системы адресной доставки генов на основе ретровирусов и аденовирусов для генной терапии in vivo.

Ретровирусные векторы

Опыт клинических испытаний с участием более 200 пациентов показывает, что дефектные по репликации ретровирусные векторы не оказывают каких-либо неблагоприятных побочных эффектов. Создана конструкция, называемая плазмовирусом, которая содержит ретровирусные гены gag и pol, «терапевтический» ген и ген env. После трансфекции плазмовирус запускает образование дефектных по репликации вирусных частиц. Вектор может переносить не более 3,5 т. п. н. ДНК, но и длина большинства потенциальных «терапевтических» кДНК и генов — супрессоров опухолей составляет 0,5—2 т. п. н. В ретровирусную векторную систему внесены дополнительные усовершенствования: уве- личено число образующихся вирусных частиц, повышена эффективность трансдукции, осуществлена генноинженерная модификация, обеспечивающая их проникновение в неделяшиеся клетки, повышена специфичность инфекции. В последнем случае геном рекомбинантного ретровирусного вектора упаковывается в оболочку другого вируса, белок которой и определяет специфичность связывания ретровируса и спектр инфицируемых им клеток. Это явление называется фенотипическим смешиванием. Фенотипически смешанный вирус получают с помощью котрансфекции клеточной линии, которая синтезирует продукты генов gag и pol, рекомбинантным ретровирусным вектором и вектором, экспрессирующим ген env другого вируса. Изменяя ген env, можно как сузить спектр инфицируемых вирусом клеток до строго определенного типа, так и расширить его. Можно добиться специфичности экспрессии терапевтического гена, осуществляя ее под контролем промотора, специфичного для определенных клеток. Аденовирусные векторы   

Аденовирусы инфицируют неделящиеся клетки человека и широко используются в качестве живых вакцин, которые предотвращают респираторные инфекции и гастроэнтериты, не оказывая побочного действия. Эти свойства делают аденовирусы перспективными для доставки генов в клетки-мишени. Для получения аденовирусного вектора провели котрансфекцию клеточной линии, синтезирующей продукты аденовирусного гена Е1, двумя участками генома аденовируса. Один из них может существовать в виде плазмиды в Е. coli и содержит вместо Е1-области «терапевтический» ген, а второй представляет собой молекулу ДНК аденовируса, которая лишена 5'-концевого участка. Рекомбинация между двумя трансфицирующими фрагментами ДНК в области их перекрывания приводит к восстановлению полноразмерного аденовирусного гена, в котором вместо Е1 -области находится терапевтический ген. Продукты гена Е1, поставляемые клеткой-хозяином, инициируют образование вирусных частиц, высвобо- ждающихся из клетки в результате лизиса. Клонирующая емкость аденовирусного вектора составляет около 7,5 т. п. н. В отсутствие рекомбинации трансфицирующие молекулы ДНК, обладающие недостаточной длиной, не могут упаковываться в вирусные частицы. Вероят- ность того, что между областью Е1 в геноме клетки-хозяина и ДНК рекомбинантного аденовируса произойдет рекомбинация с образованием компетентных по репликации вирусов, чрезвычайно мала. После того как рекомбинантный аденовирус инфицирует клетку-мишень, его ДНК проникает в ядро, где и происходит экспрессия «тера- певтического» гена. Рекомбинантная ДНК не интегрирует в хромосому и сохраняется непродолжительное время, поэтому при проведении генотерапии с использованием аденовирусных векторов необходимо вводить их с определенной периодичностью. Аденовирусные векторы использовали в клинических испытаниях по генной терапии муковисцидоза. Первые результаты не обнадеживали: ген трансмембранного регуляторного белка, нарушения в котором приводят к муковисцидозу был перенесен лишь в небольшое число клеток пациента, а многократное введение рекомбинантного аденовируса и низкий уровень экспрессии некоторых аденовирусных генов привели к развитию у пациентов выраженного иммунного ответа и гибели трансдуцированных клеток. Эту проблему решали разными путями. Например, сконструировали «пакующую» клеточную линию, содержащую El-область и ряд аденовирусных генов, которые не входят в состав трансдуцирующей ДНК и не попадают в клетки-мишени. Затем удалось добиться того, чтобы ни один из аденовирусных генов не включался в трансдуцирующую ДНК Эффективность аденовирус-опосредованного переноса генов можно повысить, если скон- струировать вирус, проникающий преимущественно в определенную клетку-мишень. Для этого в ген, ответственный за образование нитей аденовируса, следует включить последовательность, кодирующую домен белка, который связывается с клеточноспецифичным рецептором.

42. Опишите векторные системы доставки генов на основе аденоассоциированных вирусов и вируса простого герпеса для генной терапии in vivo.

Векторы на основе аденоассоциированных вирусов

Аденоассоциированные вирусы (ААВ) — это небольшие непатогенные вирусы человека с одноцепочечным ДНК-геномом (4,7 т. п. н.), который может интегрировать в специфический сайт 19-й хромосомы. Такое название они получили потому, что для продуктивной инфекции им необходимы белки другого вируса (вируса-помощника), например аденовируса. После того как ААВ попадает в ядро, его геном с помощью по- лимераз клетки-хозяина преобразуется в двухцепочечную ДНК и транскрибируется. Отсутствие патогенности делает ААВ весьма перспективным вектором для доставки в организм человека «терапевтических» генов. Рекомбинантный ААВ получают с помощью котрансфекции клетки-хозяина, инфицированной каким-нибудь аденовирусом (вирусом-помощником), двумя плазмидами. Одна из них несет «терапевтический» ген, а вторая — два его ге- на, rep и cap, ответственные за репликацию генома и синтез капсида соответственно. После лизиса инфицированных клеток рекомбинантные ААВ отделяют от аденовируса с помощью центрифугирования и диализа, а оставшиеся в образце аденовирусы (вирусы герпеса) инактивируют нагреванием. Рекомбинантный ААВ может нести ДНК-вставку размером до 4,5 т. п. н., не вызывает развития иммунного ответа, поскольку не содержит ААВ-генов, но и не может интегрировать в 19-ю хромосому из-за отсутствия гена rep. В одном из доклинических испытаний эффективность in vivo трансдукции гепатоцитов мыши (рекомбинантный ААВ вводили внутривенно) была повышена в 900 раз с помощью предварительного облучения печени нетоксическими дозами и введения нерекомбинантного (дикого типа) ААВ. В I фазе клинических испытаний по генной терапии муковисцидоза в легкие вводили CFTR-А АВ-вектор; при этом не развивалась воспалительная реакция, а вектор сохранялся до 70 сут. Чтобы определить, образуется ли продукт гена CFTR в количестве, достаточном для достижения терапевтического эффекта, нужны дальнейшие клинические испытания.

Векторы на основе вируса простого герпеса

Для того чтобы ретро- и аденовирусные векторы инфицировали специфические типы клеток, нужно модифицировать их с помощью генной инженерии, однако в природе существуют вирусы, уже обладающие сродством к определенному типу клеток. Так, вирус простого герпеса 1 типа (HSV) инфицирует нейроны и персистирует в них, часто вызывая у человека так называемые «простудные» высыпания, а иногда — энцефалит с летальным исходом. Вирус присутствует в нейронах в латентной форме, а при стрессе и гормональных нарушениях инициируется литический цикл. Вследствие тропности HSV к нервным клеткам он является подходяшим вектором для генной терапии таких заболеваний. Геном HSV представляет собой двухцепочечную молекулу ДНК длиной 152 т. п. н. Капсид вируса сливается с мембраной нейрона, и его ДНК транспортируется в ядро. Репродуктивный цикл вируса состоит из литической (репликация ДНК и образование вирусных частиц) и латентной (конденсация вирусного генома и активация как минимум двух так называемых латентно-ассоциированных промоторов) фаз. Замена сегмента геномадлиной примерно 30т. п. н. ДНК-вставкой не оказывает заметного влияния на репликацию HSV, его упаковку или инвазионную способность. С другой стороны, большой размер генома HSV затрудняет генетические манипуляции с ним. Для решения этой проблемы в плазмиду Е. coli, которая может переносить до 8 т. п. н. чужеродной ДНК, встроили «усеченный» геном HSV, состоящий из точки инициации репликации и последовательности, ответственной за упаковку. Полученные HSV-производные назвали ампликонами (ампликон-плазмидами). Большинство систем доставки генов на основе HSV предполагает использование вируса-помощника, который поставляет белки, необходимые для репликации и сборки вируса, но не образует инфекционные вирусные частицы, поскольку его геном модифицирован и не способен упаковываться. Для получения рекомбинантного HSV осуществляют трансфекцию ампликон-плазмиды в инфицированную вирусом-помощником клетку-хозяина. ДНК ампликона реплицируется по типу «катящегося кольца»: внутренняя кольцевая цепь играет роль матрицы, а во внешней происходит разрыв, и к свободной 3'-концевой ОН-группе ковалентно присоединяются нуклеотиды. Рекомбинантный HSV можно получить и с помощью котрансфекции клеток-хозяев, в которых вирус может реплицироваться, с помощью ДНК HSV дикого типа и плазмиды, которая содержит «терапевтический» ген, фланкированный последовательностями ДНК из вспомогательных участков HSV-генома. ДНК HSV дикого типа реплицируется в ядре клетки-хозяина, при этом в результате рекомбинации «терапевтический» ген может встроиться в HSV-reном. Затем частицы как рекомбинантного, так и дикого типа HSV упаковываются и высвобождаются из клеток. Доля рекомбинантных HSV в общем вирусном пуле очень мала, поэтому ви- русы размножают, а затем с помощью ПЦР или гибридизации выявляют «терапевтический» ген в образовавшихся бляшках. Рекомбинантный вирус хранят в условиях, не допускающих его загрязнения HSV дикого типа. Доклинические испытания на экспериментальных животных показали, что гены, достав- ленные с помощью HSV-векторов в клетки мозга и периферической нервной системы, экспрессируются и поддерживаются длительное время. Однако до начала I фазы клинических испытаний HSV-векторов необходимо провести дополнительные исследования.