Метод определения функционального состояния гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы

Как указывалось в обзоре литературы, в ГГАКС следует различать три основных звена: 1 – гипоталамическую регуляцию кортикотропной функции гипофиза, базирующуюся на продукции кортиколиберина нейросекреторными клетками; 2 – синтез и секрецию кортикотропина аденогипофизом; 3 – кортикостероидогенез в коре надпочечников под влиянием кортикотропина.

Изучение функций ведущих адаптационных систем ставит некоторый ряд методологических проблем, связанных с определением свободного кортизола. Важным научным инструментом в физиологии прошедшего десятилетия стала оценка уровня стероидных гормонов в слюне (Gubareva, 1996, 2001; Kirschbaum, Hellhammer, 1999). 

 

Определение концентрации кортизола в слюне

Кортизол в слюне определяли методом твердофазного иммунохемилюминисцентного анализа.

Кортизол - стероидный гормон с молекулярным весом 362 Да. Количественное определение уровня кортизола в крови имеет диагностическое значение при оценке функционирования системы гипоталамус - гипофиз - кора надпочечников.

Принцип работы набора состоит в следующем. В лунках при добавлении исследуемого образца и конъюгата кортизол-пероксидаза во время инкубации устанавливается равновесие между конъюгатом и эндогенным кортизолом сыворотки крови за связывание с антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. При удалении содержимого из лунок происходит разделение свободного и связанного антителами кортизола и коньюгата кортизол-пероксидаза причем количество связанного антителами конъюгата обратно пропорционально количеству кортизола в образце сыворотки крови.

Во время инкубации с сигнальным реагентом в лунках происходит испускание квантов света. Интенсивность свечения прямо пропорциональна количеству связанного антителами конъюгата кортизол-пероксидаза. После измерения интенсивности свечения раствора в лунках на основании калибровочной кривой рассчитывается концентрация кортизола в определяемых образцах.

 

Методы определения функционального состояния гипоталамо-гипофизарно-гонадной системы

О функциональной активности гипоталамо-гипофизарно-гонадной системы (ГГГС) допустимо судить по уровню периферических половых гормонов – эстрадиола (Э) и тестостерона (Т), поскольку концентрация последних зависит от секреции гонадотропина, продуцируемого аденогипофизом. Снижение или увеличение уровня циркулирующих в периферической крови Э и Т могут служить критерием целостности оси гипоталамус – гипофиз - кора надпочечных желез - половые железы (И.А.Држевецкая,1994). Для измерения эстрадиола и тестостерона в слюне использовали высокочувствительный конкурентный иммунологический метод.

 

Определение уровня эстрадиола и тестостерона в слюне

 

Для измерения уровня эстрадиола (Э) и тестостерона (Т) в слюне человека использовали высокочувствительный конкурентный иммунологический метод, основанный на конкуренции эстрадиола и тестостерона, содержащегося в образце, с эстрадиолом и тестостероном, меченным пероксидазой хрена (коньюгат), за ограниченное число связывающих центров – специфических антител: на эстрадиол – кроличьи антитела к ослиному глобулину и тестостерон – бараньи антитела к мышиным глобулинам. Влияние глобулина, связывающего половой гормон, нейтрализуется использованием соответствующего смещающего агента. Антитела присутствуют в жидкой фазе (реагент для анализа) и захватываются во время инкубации вторым антителом (ослиный Ig к кроличьим антителам и мышиный Ig к бараньим антителам), нанесенным на лунки. Количество коньюгата, севшего на лунку к концу инкубации, обратно пропорционально концентрации эстрадиола или тестостерона в образце. В конце инкубации не связавшийся коньюгат удаляется отсасыванием и промывкой лунок при помощи устройства для промывки Амерлайт. Пероксидазная активность связанного коньюгата измеряется по реакции усиленной люминесценции. Для инициирования реакции испускания света в лунки добавляется сигнальный реагент, содержащий люминогенные субстраты (производную люминола и соль перкислоты) и усилитель. Усилитель (замещенный фенол) увеличивает интенсивность света и продлевает его испускание. Световые сигналы считываются анализатором Амерлайт.

Концентрации эстрадиола выражаются в пг/мл или нмоль/л. Для перевода пг/мл в нмоль/л необходимо использовать следующее соотношение 1 пг/мл = 0,0037 нмоль/л.

Концентрация тестостерона выражают в нмоль/л (1 нг/мл = 3,47 нмоль/л)

Исследования Л.И.Губаревой (1999) показали, что содержание Т и Э в крови коррелирует с содержанием этих гормонов в слюне.

 

Методы статистической обработки результатов

Результаты экспериментов подвергались вариационно-статистической обработке в соответствии с принципами, изложенными в работах Бейли H. (1962), Каминского Л.С. (1964) и Лакина Г.Ф. (1990).

Вариационные ряды, полученные в эксперименте, характеризовали по следующим показателям: средняя арифметическая величина (М); квадратическое отклонение (d); ошибка средней арифметической величины или средняя; квадратическая ошибка (m).

Вычисляя показатель существенной разности (t) и учитывая число измерений по таблице t - распределения Стьюдента, определяли вероятность различий (Р). Различие считалось статистически достоверным, начиная со значений Р<0,05. В этом случае правильность вывода о существовании различий величин может быть подвержена более чем в 95% случаев.

Статистическую обработку результатов исследования проводили на компьютере с использованием статистического пакета анализа данных в Microsoft Excel – 2000 и программы «Statistica 6.0».

Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение