Общая оценка качества отсеквенированной ДНК

Исследование ДНК тканей мумий Марии и Вавиты

Баранов В.С 1., Асеев М.В. 1, Глотов А.С. 2, Глотов О.С. 2, Комиссаров А.С.3

1 – Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии, отдел

пренатальной диагностики. 2 – СПб Государственный Университет. 3 – Институт

Цитологии АН РФ, Центр генетической биоинформатики.

 

Подготовка образцов

Образцы ткани по 500 мкг переносили в пластиковые пробирки и растворяли

в 1 мл буфера (10 мМ трис-НСI рН=10.5, 1 мМ ЭДТА, 0.15 М NаСI). К полученным

суспензиям добавляли додецилсульфат Nа до 0.5% нагревали до +80 С и через 10

минут -протеиназу К (до 500 мкг/мл), помещали в термостат (+55 С) на 24 часа.

Депротеинизацию проводили фенольным способом: добавляя в равном

объеме к суспензии фенол, затем фенол:хлороформ (1:1), хлороформ; после

каждого добавления производили постоянное перемешивание на угловом роторе

и центрифугирование при 15 тыс. об.мин., 10 мин.

К полученному после 3-го центрифугирования над-осадку прибавляли 1/10

часть от объема 1 М NaCI и 2,5 объема дважды перегнанного этилового спирта,

и оставляли на ночь при -30 С в конических пробирках - "эппендорфах". Проводили

центрифугирование при 15 тыс. об. мин. в течение 10 минут и получали ДНК

"выпавшую" в виде осадка бурого цвета. Дважды промывали осадок ДНК 70%

этиловым спиртом и сушили при комнатной температуре (1 ч) и затем растворяли

в ТЕ буфере.

ПЦР проводили на программируемом термоциклере "My Cycler" ("Bio=Rad"),

используя стандартные олигопраймеры, синтезированные твердофазным

методом на объединении "Beagler" (Санкт-Петербург). Реакционная смесь для

амплификации объемом 25 мкл включала: 15 нМ каждого олигопраймера, 67 мМ

трис-HCI рН=8.8 при +25 С, 16.6 мМ(NH4) SO4, 6.7 mM MgCI2, 6.7 мкМ ЭДТА, 10 мМ

2 меркаптоэтанола, 170 мкг/мл БСА и смесь четырех основных dNTP в

концентрации 1.0 мМ каждого и термостабильную ДНК-полимеразу Thermus

thermophilis (5 ед/мкл) (НПО СибЭнзим). После денатурации (10 мин, 94 С)

проводили по 35 циклов амплификации для каждой тест-системы: 94оC -1 мин,

58о С - 1 мин, 72о С - 1 мин. Для контроля специфичности в реакцию вводили

образцы ДНК с известными генотипами по исследуемым локусам (маркерным

системам), а также контрольные пробы, содержащие смесь реагентов без ДНК.

После амплификации к аликвотам реакционной смеси (7мкл) добавляли буфер

для окрашивания и разделяли вертикальным электрофорезом в 6%-ом

полиакриламидном геле (210х150х1 мм), окрашивали этидиум бромидом и

фотографировали под ультрафиолетовым светом. Для идентификации аллелей

использовали соответствующие для данных локусов аллельные стандарты

("лэддеры").

Методика экзомного анализа ДНК человека на основе

Высокопроизводительного секвенирования с обогащением методом

Гибридизации

Было проанализировано 2 образца… Все этапы подготовки образца до ПЦР

проводились в чистых помещениях. Подготовка образца, экстракция ДНК,

амплификация отдельных фрагментов ДНК выполнялись в разных помещениях.

К концам геномной фрагментированной ДНК (~5 нг) были лигированы

специфические адаптеры (KAPA Library Preparation Kit и SeqCap Adapter Kit; Roche),

после чего был проведен двухэтапный отбор фрагментов в диапазоне длин 200-

350bp с использованием магнитных частиц AMPureXP Beads (Beckman Coulter).

Полученные фрагменты были амплифицированы с помощью праймеров,

специфичных к адаптерам, и гибридизованы с биотинилированными

специфическими зондами (NimbleGen SeqCap EZ Choice MedExome; Roche) в

течение 28 ч при температуре 47°С. В одной реакции были объединены два ДНК-

образца. Биотинилированные гибриды зондов-ДНК были выделены и очищены

стрептовидиновыми конъюгированными магнитными частицами, проведена вторая

амплификация и качественная оценка полученной ДНК-библиотеки (TapeStation

4200; Agilent Technologies). С целью удаления нецелевых фрагментов

амплификации и димеров адаптеров ДНК-библиотека была повторно очищена с

использованием магнитных частиц AMPureXP Beads (рис.1). Оценка конечной

концентрации приготовленной библиотеки была проведена на приборе Quantus с

использованием коммерческого набора QuantiFluor® dsDNA System (Promega).

Полученная ДНК-библиотека была иммобилизирована на поверхность проточной

ячейки. Секвенирование проводилось на платформе Illumina с использованием

проточной ячейки Standard Flow Cell и реагентов MiSeq Reagent Kit v2 300 (2x150

cycles).

 

Рис.1

Общая оценка качества отсеквенированной ДНК

Для начальной оценки качества были использованы стандартные методы, такие

как FastQC и оценка профиля кмеров программами Jellyfish and KraTER. Оценка

качества не показало никаких проблем с качеством отсеквенированных ридов ДНК

для обоих образцов. Картинки не приводятся так как не являются

информативными.

Для первого образца (дальше M, большая мумия «Мария») было отсеквенировано

113.4М ридов, для второго образца (дальше W, малая мумия «WaWita») было

отсеквенировано 22.9М ридов.

Следующим шагом была очистка отсеквенированных ридов от различных

технических последовательностей, которые будут мешать дальнейшему анализу.

Для этого была использована программа Cookiecutter. После очистки осталось

113.3M (99%) ридов и 22.8M (99%) ридов соответственно для M и W.