2020-01-14
110
Серебряков Е.Б., к.физ-мат. наук
Санкт Петербургский Государственный Университет
Предоставленные образцы биологических тканей были изучены следующими методами:
1. Сканирующая электронная микроскопия
2. Raman спектры
3. ICPE
4. Состав кизельгура
Характерной особенностью образцов WAWITA является сильный органический запах,
напоминающий запах горелого мяса.
Краткое описание результатов:
1. SEM + EDX
Электронная микроскопия поверхности образца проводилась с помощью сканирующего
электронного микроскопа Hitachi S-3400N с приставкой EDX в режимах SE и BSE.
В процессе исследования установлено, что поверхность всех образцов сильно загрязнена
диатомитом (он же кизельгур, инфузорная земля, горная мука, целит – далее будем употреблять
термин кизельгур), различной крупности, частицы до 100 мкм, в природе распространён широко.
Порошок кизельгура имеет техногенное происхождение, поскольку в природе он спрессован в
твердую породу, в процессе добычи и переработки порода дробят и измельчают. На поверхности
|
|
|
также встречаются песчинки, частицы алюмосиликатных пород и полевых шпатов, повсеместно
распространённых в природе.
Образец MARIA BODY представляет собой органические волокна, вид и элементный состав
соответствует животным волокнам. Поверхность образца сильно загрязнена кизельгуром,
встречаются крупные остатки перемолотых скелетов диатомовых водорослей.
Образец MARIA TOE представляет собой волокнистую структуру, вид и элементный состав
соответствует животным волокнам. Поверхность образца сильно загрязнена кизельгуром и
кристаллами хлорида кадмия размером около 20 мкм.
Образец MARIA FINGER представляет собой волокнистую структуру, вид и элементный состав
областей, свободных от кизельгура, соответствует животным волокнам. Поверхность образца
очень сильно загрязнена кизельгуром, образец белого цвета с поверхности. На поверхности
образца встречаются кристаллы хлорида кадмия.
Образец WAWITA BOTTOM 1 (кость) представляет собой пористый фрагмент кости (соотношение
элементов приближено к фосфориту). Поверхность практически не загрязнена кизельгуром. На
поверхности встречаются тела округлой формы размером около 10 кмк, содержащие биогенные
элементы (N, P, S, K, много NaCl)
Образец WAWITA BOTTOM 2 (темная масса) представляет собой пористый фрагмент кости
(соотношение элементов приближено к фосфориту). Поверхность не загрязнена кизельгуром.
Практически вся поверхность покрыта телами округлой формы размером около 10 кмк, состав
аналогичен телам на образце WAWITA BOTTOM 1.
FTIR (ATR)
С помощью прибора Horiba LABRAM HR800 были отсняты ИК-фурье спектры поверхности
|
|
|
образцов. Спектры НПВО (алмаз) снимались с максимально возможным для прибора
разрешением 4cm-1. Спектры образцов отличаются друг от друга в деталях, однако общий вид
спектра схожий и можно сделать вывод, что основа образцов из тела Марии, пальцев рук и ног
представляют один и тот же материал. Общий вид спектра образцов сильно отличается от бумаги,
папье-маше, гипса.
138
ICPE
Исследование элементного состава образцов было проведено с целью выявления
закономерностей распределения обнаруженных элементов в образцах. Исследования
выполнялись на приборе Shimadzu ICPE-9000. Пробоподготовка заключалась в разложении пробы
азотной кислотой под давлением в СВЧ-печи.
Результаты количественного и полуколичественного элементного анализа позволяют сделать
следующие выводы:
1. Содержание Al определяется степенью загрязнения поверхности образцов полевыми
шпатами. При этом содержание алюминия закономерно уменьшается в образцах, взятых
дальше от поверхности и по этой причине менее загрязнённых.
2. Содержание Ba в образцах существенно не отличается.
3. Содержание Ca обусловлено прежде всего характерными особенностями живых тканей.
Можно сделать вывод, что один из образцов Wawita представлял собой кость.
Содержание Ca в образцах MT и MF одинаковое в пределах точности эксперимента, но
оно сильно отличается от MB.
4. Все образцы с поверхности загрязнены Cd. Происхождение кадмия неизвестно,
существенное содержание кадмия на образцах, отобранных, по-видимому, с поверхности,
оно больше чем в образцах, отобранных из толщи объекта. На это косвенно указывает
отсутствие кадмия в костной ткани (хотя там он должен накапливаться) и уменьшение
концентрации кадмия пропорционально степени загрязнения поверхности. Сопоставление
данных с SEM позволяет утверждать, что кадмий был внесён в образцы с поверхности в
виде хлорида кадмия, который не встречается в природе (в частности, в кизельгуре). Одно
из применений хлорида кадмия – использование в качестве протравы при крашении
растительных волокон (краска лучше закрепляется).
5. Cu в образцах содержится в сопоставимых количествах, содержание не отличается
значительно от образца к образцу.
6. Содержание Fe в образцах схожее, но результаты анализа не позволяют сделать каких-
либо надёжных выводов, т.к. его содержание определяется как загрязнением
поверхности, так и естественным содержанием в тканях в виде различных белковых
комплексов, таких как гемоглобин, некоторые соли и др.
7. Содержание K, который должен быть равномерно распределён в живых тканях, несколько
разное – оно меньше в образце MF. Это может быть связано как с ошибкой определения
(K-один из самых сложных элементов для определения ICPE, ошибка определения обычно
составляет около 20%), так и с разным происхождением образцов.
8. Содержание Mn в образцах одинаковое.
9. Содержание Na, полученные данные свидетельствуют о большой погрешности его
определения методом ICPE, как и K. Кроме того, поскольку SEM выявил в некоторых
образцах кристаллы NaCl на поверхности, есть вероятность его сильно неравномерного
распределения вследствие естественной причины – высолов на поверхности высыхающих
образов в виде кристаллов.
10. Содержание Sr повышено в костной ткани и примерно одинаковое для образцов MT, MF,
MB.
11. Содержание Zn одинаковое в образцах MB и MT и существенно меньше в MF. Связать
наличие Zn c загрязнением поверхности не получается, т.к. MF сильнее всего загрязнён c
поверхности, а WB 1 слабо загрязнён.
12. Редкоземельные элементы в определяемом диапазоне не обнаружены.
Можно сделать выводы:
1. Все образцы представляют собой биологические ткани, образец MF имеет ту же основу,
что и MT, MB - это биологические волокна (не бумага, не гипс, не древесина и т.п.).
|
|
|
2. Поверхность образцов была обработана препаратом кадмия (наиболее вероятно –
хлоридом кадмия, кристаллы которого были найдены методом SEM).
139
3. Кизельгур, которым загрязнены образцы – природное вещество, прошедшее
технологическую обработку: дробление, измельчение.
4. Элементный состав образцов, в целом, похожий, нет необъяснимого значительного
отличия элементного состава образов, хотя есть некоторая разница.
Отчет. Генетический Анализ образцов ткани мумий найденных в Перу
Ноябрь 09.2018
Исполнители:
CEN4GEN labs (6756 – 75 Street NW Edmonton, AB Canada T6E 6T9) – подготовка и
секвенирование образцов.
ABRAXAS BIOSYSTEMS S.A.P.I. DE C.V. (Мексика) – компьютерный анализ данных.
После предварительного анализа на качество из 7 представленных образцов 3 образца были
отобраны для анализа.
Таблица 1. Образцы для анализа
| Обозначение | Оригинальное название | Условное имя | рисунок |
| Ancient-0002 | Neck Bone Med Seated 00-12 Victoria 4 | Виктория | Рис. 3. |
| Ancient-0003 | 1 Hand 001 | Отдельная рука с 3 пальцами | Рис. 4 |
| Ancient-0004 | Momia 5 -DNA | Виктория | Рис. 3. |
3.
4.
Для этих образцов были выполнены следующие операции:
1. Извлечение ДНК.
2. Проверка качества ДНК.
3. Мультиплицирование ДНК.
4. Создание библиотеки ДНК.
5. Секвенирование ДНК.
6. Формирование очищенных секвенированных данных.
7. Контроль качества.
8. Предварительных анализ наложением ДНК ридов на геном человека.
9. Анализ для выделения коротких ридов ДНК типичных для древних ДНК.
10. Наложение ДНК ридов Ancient0003 на имеющиеся библиотеки генома человека.
11. Митохондриальный анализ для обнаружения вариантов D-петель и других
информативных участков для определения митохондриальных гаплотипов.
12. Определение половой принадлежности образцов Ancient0003.
199
13. Выявление возможных посторонних организмов в образцах.
14. Анализ баз данных ДНК для выявления сходства с известными организмами.
Для выявления возможных типов организмов, присутствующих в образцах Ancient0004 и
|
|
|
Ancient0002 (Виктория) был проведен геномный ДНК скетчинг DNA sketching (Ondov et al.,
2016), в котором используется сопоставление групп коротких фрагментов, k-mers, с
доступными базами данных. Был использован программный пакет bbtools software
(https://jgi.doe.gov/data-and-tools/bbtools/)
Были проверены следующие организмы:
1. Bacteria
2. Virus
3. Plasmids
4. Phages
5. Fungi
6. Plastid
7. Diatoms
8. Human
9. Bos Taurus
10. H penzbergensis
11. PhaseolusVulgaris
12. Mix2: Label for the following genomes:
• Lotus japonicus chloroplast, complete genome
• Canis lupus familiaris cOR9S3P olfactory receptor family 9 subfamily S pseudogene
(cOR9S3P) on chromosome 25
• Vigna radiata mitochondrion, complete genome
• Millettia pinnata chloroplast, complete genome
• Curvibacter lanceolatus ATCC 14669 F624DRAFT_scaffold00015.15, whole genome
shotgun sequence
• Asinibacterium sp. OR53 scaffold1, whole genome shotgun sequence
• Bacillus firmus strain LK28 32, whole genome shotgun sequence
• Bupleurum falcatum chloroplast, complete genome
• Alicycliphilus sp. B1, whole genome shotgun sequence
• Bacillus litoralis strain C44 Scaffold1, whole genome shotgun sequence
• Chryseobacterium takakiae strain DSM 26898, whole genome shotgun sequence
• Paenibacillus sp. FSL R5-0490
• Bacillus halosaccharovorans strain DSM 25387 Scaffold3, whole genome shotgun sequence
• Rhodospirillales bacterium URHD0017, whole genome shotgun sequence
• Bacillus onubensis strain 10J4 10J4_trimmed_contig_26, whole genome shotgun sequence
• Radyrhizobium sp. MOS004 mos004_12, whole genome shotgun sequence
• Bacillus sp. UMB0899 ERR1203650.17957_1_62.8, whole genome shotgun sequence
13. Vertebrates: Label for the following genomes:
● Amblyraja-radiata_sAmbRad1_p1.fasta
● bStrHab1_v1.p_Kakapo.fasta
● bTaeGut1_v1.p_ZebraFinch.fasta
● GCA_000978405.1_CapAeg_1.0_genomic_CapraAegagrus.fna
● GCA_002863925.1_EquCab3.0_genomic_Horse.fna
● GCF_000002275.2_Ornithorhynchus_anatinus_5.0.1_genomic.fna
● GCF_000002285.3_CanFam3.1_genomic.fna
● Macaco_GCF_000772875.2_Mmul_8.0.1_genomic.fna
● rGopEvg1_p1_Gopherus_evgoodei_tortuga.fasta
14. Protozoa
После всех фильтров было получено 27974521 ридов для Ancient0002 и 304785398 ридов
для Ancient0004. Это показывает, что 27% ДНК из образца Ancient0002 и 90% ДНК из
200
образца Ancient0004 не может быть идентифицировано с анализированными образцами
ДНК организмов из доступных баз данных.
Следующий этап анализа был выполнен при помощи программ megahit v1.1.3 (Li et al.,
2016). Был получен следующий результат:
Ancient0002: 60852 contigs, total 50459431 bp, min 300 bp, max 24990 bp, avg 829 bp, N50 868
bp, 884,385 (5.39%) assembled reads
Ancient0003: 54273 contigs, total 52727201 bp, min 300 bp, max 35094 bp, avg 972 bp, N50 1200
bp, 20,247,568 (65.69%) assembled reads
Результат анализа представлен на рисунке.
Заключение
В результате проведенного анализа было показано отсутствие соответствия образцов
Ancient0002 и Ancient0004 (Виктория) геному человека, в то время как образец Ancient0003
хорошо соответствует человеческому.
