Исследования функционирования клетки. Мембранная теория

Биохимические исследования позволили выяснить топографию метаболических механизмов клетки. Удалось приурочить химическую динамику к определенным клеточным структурам, связать морфологию и биохимию. Ценные данные в этом направлении получены гистохимией (см. главу. 10).

Для понимания функционального значения ряда внутриклеточных образований много дал способ разделения содержимого разрушенных клеток (клеточных гомогенатов) на отдельные фракции, содержащие преимущественно определенные клеточные структуры – ядра, митохондрии, микросомы и др. Такие фракции получают посредством центрифугирования гомогенатов при большой скорости вращения. Затем их подвергают биохимическому исследованию для определения ферментативных свойств и химического состава. В результате оказалось, что между различными их частями и даже между макромолекулами клеточных биополимеров имеется строгое разделение функций. Митохондрии, в которых происходит окислительное фосфорилирование, представляют собой энергетические центры клеток; рибосомы, содержащие рибонуклеиновую кислоту, – место сборки клеточных белков, а лизосомы – структуры, в которых сосредоточены гидролитические ферменты (см. также главу 10).

Химические процессы, протекающие внутри клетки, осуществляются по конвейерному принципу. Так, находящиеся внутри митохондрий ферменты, участвующие в окислительных процессах, пространственно разграничены, будучи фиксированы на различных мембранах, благодаря этому те или иные вещества подвергаются ряду последовательных превращений. Такие последовательные превращения продуктов обмена происходят, например, в ходе цикла трикарбоновых кислот (цикла Кребса), обеспечивающего энергией клетку. Так же последовательно, звено за звеном происходит сборка в клетке белков из аминокислот на рибонуклеиновой матрице.

Успешное развитие биохимических исследований клетки привело к возникновению новой области науки – биохимической цитологии (подробнее см. в главе 10).

Крупными достижениями ознаменовалось за последние 25 лет изучение клетки экспериментально‑физиологическими и биофизическими методами. Стало возможным не только увидеть внутреннее строение клетки, но и как бы «потрогать» ее. В отличие от морфолога, обычно рассматривающего мертвые, фиксированные объекты, или биохимика, имеющего дело, как правило, с разрушенными клетками, физиолог исследует живую клетку.

Для цитофизиологических исследований требуется выделение отдельных клеток или их частей (например, нервных волокон) и их помещение в такие условия, в которых они по возможности более длительное время сохраняют свою жизнедеятельность. Начиная с 1929 г. были разработаны способы выделения одиночного мышечного или нервного волокна или рецептора с подходящим к нему нервным волокном и выбраны удобные для этой цели объекты. Для изучения физиологии нервного волокна необычайно полезными объектами оказались гигантские аксоны морских моллюсков (кальмара, каракатицы), диаметр которых достигает 0,5–1 мм. Начало использованию этих аксонов в физиологических экспериментах было положено в конце 30‑х годов К.С. Колом, Г.Дж. Картисом и А. Ходжкиным и успешно продолжается и сейчас. В экспериментах на аксонах кальмара, выполненных в 60‑х годах, выявилась возможность использовать в качестве объекта исследования наряду с целым нервным волокном и его поверхностную мембрану. Последняя после выдавливания из нее цитоплазмы и заполнения ее солевым раствором – способна длительно функционировать, генерируя и проводя нервные импульсы. Результаты, полученные в опытах на аксонах кальмара, служат хорошей иллюстрацией того, что в физиологии выбор объекта и метода часто определяет успех в решении стоящей перед исследователем задачи.

Повышение чувствительности современной аппаратуры позволило решить задачу регистрации и количественного учета многих процессов, протекающих в живой клетке. Одновременно с этим в настоящее время физиология располагает рядом способов воздействия на ход внутриклеточных физиологических процессов.

Особое значение в изучении физиологии клетки и решении многих проблем общей физиологии приобрела микроэлектродная техника, предложенная в 1946–1949 гг. Р. Джерардом с сотрудниками и получившая широкое распространение в физиологических лабораториях всего мира. Посредством стеклянных микроэлектродов с диаметром кончика менее 0,5 мк. регистрируют с применением специальных электронных усилителей и малоинерционных электроизмерительных приборов трансмембранные потенциалы одиночных клеток. Таким способом определены особенности трансмембранных электрических потенциалов в разных возбудимых образованиях и в разных условиях, в том числе при изменении концентрации ионов и при действии различных веществ; изучена ионная проводимость и измерены электрические свойства (емкость, сопротивление) поверхностной мембраны клеток. Посредством микроэлектродного отведения удалось также зарегистрировать разность потенциалов между ядром и протоплазмой клетки.

Внутриклеточные микроэлектроды применяются и для воздействия на клетку: для электрического раздражения одиночный клетки и для введения в нее посредством электрофореза различных веществ, в частности, для изменения содержания отдельных ионов.

Физиологические исследования, проведенные при помощи микроэлектродной техники и многих биохимических и биофизических методик, выявили значение поверхностной мембраны в жизни клетки. Оказалось, что она является возбудимым образованием – генератором электрических потенциалов и что свойства поверхностной мембраны определяют транспорт различных веществ в клетку и из нее во внешнюю среду.

Создание А. Ходжкиным, Э. Хаксли и Б. Катцем в конце 40‑х и в начале 50‑х годов современной мембранной теории[91] возникновения биоэлектрических потенциалов явилось выдающимся достижением общей физиологии. Согласно одному из исходных представлений, на котором основывается эта теория, концентрация ионов К⁺ внутри клетки во много раз выше, а концентрация ионов Na⁺ ниже, чем в межклеточном пространстве. В состоянии покоя поверхностная мембрана клетки свободно проницаема для растворенных в цитоплазме ионов K⁺ и малопроницаема для находящихся во внешней среде ионов Na⁺; при возбуждении мембрана становится свободно проницаемой и для ионов Na⁺.

В покое в результате направленного наружу тока ионов K⁺ держится постоянная разность потенциалов по обе стороны мембраны (мембранный потенциал покоя), и последняя оказывается поляризованной. При возбуждении происходит лавинообразное нарастание проводимости натрия, превышающее проводимость калия, и ионы Na⁺ проникают в клетку из внешней среды. Мембрана при этом деполяризуется и даже приобретает заряд противоположного знака. Такое изменение разности потенциалов по обе стороны клеточной мембраны представляет собой мембранный потенциал действия. Его особенностью является то, что он распространяется вдоль клеточной мембраны и может вызывать возбуждение смежных клеток.

Возникновению распространяющегося потенциала действия всегда предшествует местный процесс – нераспространяющаяся локальная деполяризация. Последняя должна достигнуть некоторой величины – критического уровня деполяризации, когда происходит быстро нарастающая так называемая регенеративная деполяризация. Когда же потенциал действия достигает максимальной величины, проницаемость мембраны по отношению к ионам Na⁺ падает и происходит увеличение проводимости калия. Вследствие этого мембрана реполяризуется и приобретает исходный заряд.

Решающие доказательства мембранной теории были получены в экспериментах, в которых исследовалось влияние на потенциалы покоя и действия изменений концентрации ионов K⁺ и Na⁺ во внешней среде, в опытах с определением движения радиоактивных изотопов натрия и калия сквозь мембрану нервных волокон и экспериментах на изолированных мембранах гигантских аксонов, нейроплазма которых была заменена раствором хлористого калия. Все эти эксперименты убедительно доказали, что трансмембранные потенциалы обусловлены ионной проницаемостью поверхностной мембраны. Токи ионов калия и натрия зависят от разности их концентраций в цитоплазме и внешней среде. Поэтому выход К⁺ из клетки и поступление в нее Na⁺ называют пассивным транспортом ионов. Направление ионных потоков через мембрану в покое и при возбуждении Ходжкин и его сотрудники предложили определять, фиксируя напряжение на мембране и регистрируя проходящие через нее электрические токи.

От процессов пассивного ионного транспорта отличают активный транспорт ионов. Он осуществляется за счет энергии обмена веществ клетки и направлен против концентрационных градиентов ионов; из клетки выкачиваются ионы Na⁺ («натриевый насос») и в нее поступают ионы K⁺.На наличие подобных процессов в сердечной мышце указывал еще в 1902 г. Е. Овертон на том основании, что содержание калия и натрия в сердце старика и юноши одинаково. Многочисленные экспериментальные доказательства наличия процессов активного ионного транспорта были получены в 50‑х годах. В это же время выяснилось, что движение ионов против концентрационных градиентов происходит за счет энергии, освобождаемой при расщеплении АТФ под влиянием локализованной на мембране так называемой Na, К‑аденозинтрифосфатазы. Последняя активируется ионами калия на внешней поверхности мембраны и ионами натрия на внутренней ее поверхности, т. е. при тех сдвигах концентрации ионов, которые возникают в результате пассивного ионного транспорта.

Мембранная теория Ходжкина‑Хаксли получила свое математическое выражение в виде модифицированных уравнений В. Нернста и системы дифференциальных уравнений, позволяющих предсказать, какие изменения претерпят биоэлектрические потенциалы при воздействиях на мембрану и при сдвиге ионных концентраций внутри и снаружи клетки.

Мембранная теория происхождения биоэлектрических потенциалов, разъяснив значение ионного транспорта в процессе возбуждения, поставила, как это всегда бывает при каждом крупном открытии в науке, перед исследователями большое число новых вопросов. Какова конструкция клеточных мембран и как она изменяется при раздражении. Каков механизм ионной проводимости в покое и при возбуждении? Имеются ли в мембране поры, избирательно пропускающие определенные ионы? Исследование этих вопросов, которыми настойчиво занимаются во многих лабораториях мира, является очередной и важной задачей физиологии и смежных с ней дисциплин. Избирательная проницаемость биологических мембран составляет основу представлений о функциях гисто‑гематических и гемато‑энцефалического барьеров. Возникла новая область физиологии и биологической физико‑химии – мембранология, занимающаяся изучением проницаемости различных мембран.

Идеи, лежащие в основе мембранной теории биоэлектрических потенциалов, оказали влияние на разработку различных проблем физиологии. Так, сложилось новое понимание природы процесса, обусловливающего автоматическую активность сердца. В 1952 г. С. Вейдман при помощи внутриклеточных микроэлектродов обнаружил, что в волокнах сердца, обладающих способностью к автоматии (их называют водителями ритма), в диастоле происходит медленная спонтанная деполяризация. Последняя, достигнув определенного уровня, вызывает распространяющийся потенциал действия, который служит импульсом, возбуждающим сокращение сердца. Анализ этого явления с позиций мембранной теории привел к экспериментально обоснованному выводу, что автоматия связана с особенностями ионной проницаемости мембраны волокон водителей ритма сердца.