Методика проведения экспериментальных исследований

Задача поиска соотносимых параметров отклика на клеточном уровне может быть решена только при следующих условиях:

― использование фазоконтрастной микроскопии, поскольку другие способы наблюдения не дают возможности исследовать отклик живых микрообъектов (в обычных микроскопах для такого микроанализа используется окрашивание образца, что для биообъектов допустимо только в крайне ограниченном числе случаев, т.к. живые клетки и ткани при окрашивании погибают;

― исследование микрообъектов в жидкой среде, в максимальной степени воспроизводящей условия их функционирования in situ;

― точное позиционирование источника НОИ относительно исследуемого микрообъекта с целью определения полученной им дозы облучения;

― априорное задание оптических характеристик среды, в которой находится микрообъект;

― микровидеосъемка с последующим анализом наблюдаемых процессов посредством цифровых методов обработки изображений.

В соответствии с этими условиями в настоящей работе используется поляризационно-интерференционный микроскоп (ПИМ) типа BIOLAR, снабженный видеонасадкой на основе камеры QuickCam Pro 4000 (рис. 3,4), и гелий-неоновый лазер, работающий на длине волны 632,8 нм.

Рисунок 3 Микроскоп BIOLAR

Рисунок 4 Установленная на микроскоп видеонасадка с возможностью представления изображения на дисплее ПК.

Особенности поляризационно-интерференционного метода выгодно отличают его от других фазоконтрастных методов значительным расширением возможностей в отношении количественного микроанализа. Он пригоден для исследования практически любых прозрачных микрообъектов, а также для прецизионных измерений оптических путей, показателей преломления, двойного лучепреломления, поглощения, концентраций и других биофизических величин, связанных с оптическими свойствами микрообъектов. Но главным достоинством метода является возможность наблюдения биологических микрообъектов в состоянии, максимально приближенном к естественному (in situ), поскольку никаких разрушающих воздействий типа наложения сильных электрических полей (как в атомно-силовом микроскопе) или облучения высокоэнергичным электронным пучком (как в электронном микроскопе) на объект не оказывается [8]. Внешний вид микроскопа типа BIOLAR показан на рисунке 3.

 

Кровь разбавляется физиологическим раствором в различных отношениях, затем строго отмеренная шприцом или пипеткой капля помещается на предметное стекло поляризационно-интерференционного микроскопа типа BIOLAR.

Рисунок 5 Типичная картина пула эритроцитов, наблюдаемая в микроскопе BIOLAR

Наблюдение ведется в «квазииммерсионном» режиме, т.е. 100-кратный объектив микроскопа приводится в контакт с образцом, смачивающим фронтальную линзу. Изображение через фотоокуляр передается на видеокамеру, затем в виде цифрового сигнала поступает на входной порт ПК и записывается в файл. Типичная картина пула эритроцитов показана на рис. 5.

В качестве источника используется гелий-неоновый лазер типа ЛГ-75-1, излучение которого пропущено через кварцевый световод (рис. 6).

Рисунок 6 Вывод излучения гелий-неонового лазера через кварцевый световод с помощью оптического согласующего устройства

Мощность на выходе световода зависит от параметров световода и качества согласования лазерного пучка с проксимальным торцом световода, встроенным в узел ввода. Для наблюдения гемолиза эритроцитов достаточна выходная мощность 10-15 мВт.

Рисунок 7 Позиционирование дистального торца световода относительно препарата на предметном стекле микроскопа

Позиционирование дистального торца световода перпендикулярно оптической оси относительно образца взвеси эритроцитов, помещенного под микроскоп, осуществляется посредством закрепления световода в цанговом зажиме с выведением наружу измеряемого прецизионным штангенциркулем отрезка (рис. 7).

Зная длину этого отрезка и положение образца (капли взвеси эритроцитов, помещенной на предметное стекло микроскопа), можно рассчитать мощность (световой поток), приходящийся на наблюдаемую под микроскопом часть образца (препарат в поле зрения). Полагая, что за время облучения (до 20 мин) уровень мощности лазера не меняется, этот расчет позволяет определить экспозиционную дозу.

Факт гемолиза эритроцитов под действием лазерного излучения проявляется в изменении средней по полю зрения величины контраста объект/фон. Соответствующая обработка изображения может проводиться как в рамках стандартизированного пакета программ (типа Photoshop, Colour Contrast Analyser и т.п.), так и специально разработанной под данную задачу программы, определяющей контраст интенсивностей в выбранном участке изображения и устанавливающей соотношение площадей участков с большей и меньшей из заданных интенсивностей. В первом приближении такая программа позволяет количественно охарактеризовать процесс частичного и полного гемолиза эритроцитов и тем самым дать набор значений соотносимых параметров.