Основные физико-химические свойства эритроцитов

Г.Н. Змиевской

 

ИЗУЧЕНИЕ ГЕМОЛИЗА ЭРИТРОЦИТОВ ПОД ДЕЙСТВИЕМ

НИЗКОИНТЕНСИВНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ

 

 

Методические указания

к выполнению лабораторных работ

по курсу

«Лазерные медицинские системы»

 

Под редакцией А.В. Самородова

 

Москва                                                              2019

 

Введение

 

Лазерное излучение вызывает в биологических системах заметные функционально-физиологические сдвиги в их жизнедеятельности.

С одной стороны, фотофизическое и фотохимическое действие может оказывать только то излучение, которое поглощается данной системой. С другой стороны, невозможно произвести заметный терапевтический эффект, если поглощение оказывается слишком сильным и практически все излучение поглощается поверхностными слоями биоткани, не достигая даже дермы, где сосредоточены кровеносные сосуды малого диаметра (капилляры, артериолы и венулы). Кроме того, поглощаемые кванты должны обладать, во-первых, достаточной энергией для возбуждения биомолекул, во-вторых ― их энергия не должна быть столь велика, чтобы необратимо разрушать химические связи.

В большинстве работ, посвященных анализу механизмов воздействия лазерного излучения на биообъекты, из этого немедленно делается вывод о необходимости выяснения первичного акцептора, т.е. вещества, непосредственно отвечающего за ту цепочку фотофизических и фотохимических превращений, которые в конечном счете дают необходимый лечебный эффект. Этот вопрос ставился еще с периода начального «бума» на фототерапию времен Института светолечения, открытого в 1896 г. в Копенгагене будущим Нобелевским лауреатом Нильсом Рюбергом Финзеном (N. Finsen) [1]. Однако не только Хаусманн (W. Hausmann, наиболее выдающийся немецкий фототерапевт [2]), спустя 30 лет после Финзена, но и сегодняшние исследователи (а это уже спустя более 100 лет) вынуждены признать, что должной ясности с пресловутым первичным акцептором так и не достигнуто.

По нашему мнению, для «прорыва» в фотомедицине, позволяющего наконец достигнуть должной степени понимания механизмов воздействия низкоинтенсивного оптического излучения (НОИ) на организм, необходим принципиально новый взгляд на вещи, т.е. вместо проблемы выяснения первичного акцептора следует рассмотреть смежную проблему, решение которой способно дать ответ и на вопрос об акцепторе, но может быть получено более доступными средствами и методами. Такой ключевой проблемой, позволяющей по-новому взглянуть на разработки и эксплуатацию фототерапевтических устройств, является проблема биодозиметрии.

В центр внимания, таким образом, попадает не само воздействие, а отклик организма, причем в тесной увязке с воздействием через соотносимые параметры. Но тогда на первый план выходит анализ спектра биологического действия.

Напомним, что спектр биологического действия (СБД) — зависимость относительной эффективности наблюдаемого биологического отклика от длины волны падающего излучения [3].

Все излучение, поглощаемое биообъектом, формирует его спектр поглощения (СП). СБД формируется только теми подсистемами, которые инициируют данный эффект. Поэтому естественно называть подсистемы, ответственные за СБД, дифференциальными (в отличие от фоновых, ответственных за весь СП).

Часто СБД рассматривается как аддитивная часть СП [3]. Но такое рассмотрение можно признать корректным только в том случае, когда имеется рецепт выделения СБД из СП. Аддитивность СБД по отношению к СП можно рассматривать только в случае линейности взаимодействия лазерного излучения с биосредой, что имеет место в крайне редких случаях. Более того, практически вся совокупность взаимодействий электромагнитного излучения оптического диапазона с биообъектами носит, как правило, нелинейный характер, поскольку оптические характеристики биообъектов существенным образом изменяются в процессе взаимодействия. Поэтому для исследования СБД необходимы методические компромиссы, неизбежные для переходов с одного системного уровня на другой.

Практическое выполнение условий этих переходов представляет большие практические затруднения. Поэтому приводимые в литературе сведения об измерении СБД в большинстве несостоятельны с методической точки зрения.

Это связано прежде всего с длительным засильем редукционизма в молекулярной биологии [4], имевшим место в течение всей второй половины минувшего века. Еще в 1930-х годах Паскаль Джордан, один из основателей квантовой теории, предложил ввести понятие «квантовая биология», имея в виду ориентацию биологии на новейшие достижения в физике и химии. Но после открытия двойной спиральной структуры ДНК большинство ведущих ученых приняли парадигму «расчленения» больших систем, предполагающую, что поведение таковых можно понять и объяснить, анализируя поведение их составных частей без поиска нового качества при переходе на более высокие системные уровни. Она-то и получила наименование редукционизма и привела к фактическому застою в биологии к концу ХХ века, поскольку на фоне бурного развития исследований на молекулярном и субмолекулярном уровнях интенсивность исследований на макроуровнях (тканевом, органном, организменном) упала ниже допустимых пределов [4].

Положение изменилось к лучшему в 90-х годах минувшего века, когда появилось новое направление в науке, получившее название «биофотоника». Эта область знаний образовалась на стыке квантовой оптики и биологии, акцентируя внимание на коллективных квантовых эффектах при взаимодействии электромагнитного излучения с биообъектами. В сущности, биофотонику можно рассматривать как логически неизбежный союз биологии и квантовой электроники, вступившей к этому времени в пору научной зрелости. Рождение биофотоники представляет собой важный шаг вперед в понимании существа биологии как системно-комплексной области знаний. Именно, биология изучает объекты, которые являются достаточно сложными, чтобы соответствовать названию живых систем. Их существование и функционирование невозможно понять, просто расчленяя их на составные части вплоть до молекулярного уровня, как это длительное время делалось под влиянием парадигмы редукционизма. В этом отношении биофотоника предоставляет уникальную возможность для реализации системного подхода при переходе с молекулярного на более высокие системные уровни. Реализация такого системного подхода при изучении живых систем позволяет снова ввести в обращение термин «квантовая биология», имея в виду наличие коллективных квантовых эффектов на системных уровнях выше молекулярного (вплоть до организменного). Тем самым биофотоника и биофотонные исследования [4] имеют особое значение для «переоткрытия» и настоящего наполнения понятия «квантовая биология» современными достижениями физики и химии.

Проблема выяснения механизмов действия НОИ на биообъекты является центральной как для медиков и биологов, так и разработчиков аппаратуры в течение вот уже почти 40 лет развития низкоинтенсивной лазерной терапии (НИЛТ). Пока она далека от разрешения, хотя сам факт резкого повышения интереса к НИЛТ в последние 10 лет говорит о положительных сдвигах в ее изучении.

В среде медиков и биологов сформировалось представление о специфичности и неспецифичности взаимодействия НОИ с живыми организмами. Специфическим называют взаимодействие света и биообъекта, связанное с интенсивным молекулярным поглощением света, т.е. таким, для которого установлены «специфические» фотоакцепторы, осуществляющие первичное поглощение света и запускающие затем ряд «специфических» фотохимических реакций. Типичный пример такого взаимодействия — фотосинтез. Соответственно, неспецифическим взаимодействие считается тогда, когда биологический отклик велик, а поглощение света настолько мало, что однозначно установить первичный акцептор не представляется возможным. Именно этот аспект — установление первичных акцепторов при отсутствии сильного поглощения — и вызывает наиболее ожесточенные дискуссии, поскольку превращение неспецифического взаимодействия в специфическое открывает путь к практическому применению НИЛТ не на эмпирической, а на строго научной основе и тем самым позволяет осуществить продвижение в решении проблемы дозиметрии.

Спектральный диапазон, в котором работают фототерапевтические аппараты, соответствует «окну прозрачности» биотканей (600-1200 нм) и находится далеко от характерных полос электронного поглощения всех известных хромофоров организма (исключение — пигменты глаза, поглощающие на линиях 633 и 660 нм). Следовательно, ни о какой значительной (по сравнению с падающей) поглощенной энергии не может быть и речи.

Тем не менее, под действием НОИ наблюдается целый ряд клинических эффектов, которые в течение длительного времени служат основой НИЛТ. Если попытаться обобщить все эти эффекты, то можно сформулировать неспецифическое интегральное действие на клеточном уровне: лазерное излучение воздействует на функциональную активность клеток. При этом оно не меняет самой функции, но может усиливать ее интенсивность. Иначе говоря, под действием НОИ изменяется скорость процессов клеточного метаболизма. На физико-химическом языке это означает, что потенциальные барьеры ключевых биологических реакций меняют свою высоту и ширину. В частности, НОИ может сильно повлиять на мембранный потенциал. С ростом напряженности поля мембраны активационные барьеры ферментативных реакций, завязанных на мембранный транспорт, снижаются, обеспечивая тем самым экспоненциальный рост скорости ферментативных реакций [5].

При воздействии НОИ на клеточном уровне наиболее рациональным путем поиска соотносимых параметров отклика является исследование состояния мембран — один из способов оценки динамической активности живых клеток. Из всех биологических сред в этом смысле наиболее доступной и диагностически значимой является кровь, состоящая в основном из эритроцитов. Более того, именно кровь испытывает непосредственное воздействие НОИ во время сеансов фототерапии.

Эритроциты — наиболее часто используемые в экспериментах клетки. Это объясняется в первую очередь их доступностью. Кроме того, эритроциты довольно долго живут вне организма, что позволяет исследовать клетки живыми. По состоянию эритроцитов можно судить о многих характеристиках организма.

Предположение о радикальном изменении свойств клеточной мембраны под действием НОИ можно считать общепринятой рабочей гипотезой. Учитывая нелинейность эффекта и его дозозависимость, естественно предположить, что существуют минимальная доза облучения, ниже которой клетка никак не реагирует на воздействие НОИ, и максимальная, при превышении которой должно происходить разрушение мембраны. Между ними должна лежать оптимальная доза, вызывающая максимум лечебного эффекта при минимуме вложенной энергии воздействия.

Вторичные процессы иначе называют темновыми, имея в виду то, что многие реакции на клеточном уровне, вызванные облучением, происходят достаточно долго после прекращения облучения. Например, синтез ДНК и РНК после 10-секундного облучения наблюдается через 1,5 часа. Обилие возможных вторичных механизмов на сегодня не дает построить более-менее убедительный «мостик» между клеточным и тканевым уровнем, подобный «когерентности» ориентации водной матрицы. Тем не менее, накопление данных говорит в пользу преобладания окислительно-восстановительных процессов [5].

Дозовая зависимость эффекта может принимать специфический характер. Выделяют три дозовых порога:

― минимальная доза, вызывающая изменения на клеточном уровне;

― оптимальная доза, вызывающая а) усиление морфообразовательных процессов, б) ускорение пролиферации, в) дифференциацию клеток;

― предельная доза, при которой стимуляция сменяется снижением пролиферационной активности.

Количественное выражение дозовых порогов зависит от многих параметров (характеристик воздействия, функционального состояния ткани, общего состояния организма [6]). В целом легко установить системную связь между сложностью выяснения механизмов и уровнем организации, на котором мы желаем устанавливать какие-либо закономерности: чем выше поднимаемся по иерархии, тем заметнее роль эмпирики. Выделение первичного фотоакцептора на молекулярном уровне позволяет построить, хоть и с немалыми трудностями, картину вторичных эффектов на субклеточном и клеточном уровнях. Переход от клеточного к организменному уровню может быть качественно описан, опираясь на представление о передаче энергии возбуждения водной матрице. Наиболее просто это можно представить в случае внутривенного облучения крови (кстати, такая методика НИЛТ была «пионером» среди всех «узаконенных» методик лазерной терапии, получив еще в 1984 г. разрешение Комиссии МЗ СССР на применение в клинической практике) [7].

Выходящее из торца световода внутрь вены излучение можно считать полностью поглощаемым кровью, поскольку после ряда актов рассеяния наружу ничего не выходит. Следовательно, зная мощность на выходе световода и время экспозиции, можно вычислить поглощенную дозу. Соответственно можно рассчитать и число N активных молекул, генерированных за процедуру. Оптимальная активация происходит при одном и том же универсальном значении N_o, независимо от возраста, пола, веса и других особенностей организма. Из всей энергии излучения, поглощаемой кровью, на возбуждение молекул кислорода расходуется примерно 1•10^-5 часть [6]; остальные 99,999% энергии превращаются в тепловую, которая, ввиду малости абсолютного значения поглощенной энергии, не оказывает на процесс заметного влияния. В каждом элементарном акте, т.е. генерации и активации одной молекулы синглетного кислорода, выделяется одно и то же количество электромагнитной энергии. Соответствующая энергия, полученная молекулой кислорода, не сосредотачивается в месте поглощения энергии излучения, а распространяется по всей кровеносной системе. Поэтому для диагностических целей можно брать пробы крови в любой части тела, например, из пальца.

Молекулярная структура воды, являющейся растворителем форменных элементов крови, универсальна, как и внутримолекулярная структура универсального фоторецептора — кислорода. Поэтому универсален закон их совместного возбуждения (дисперсионной среды) и активации взвешенных в водной матрице частиц (дисперсной фазы), в частности, эритроцитов.

У здорового человека эритроциты в основном активированы, и он практически не ощущает результатов светового воздействия. Однако в организме больного их активность снижена, и фотоиндуцированный процесс получает продолжение. Ввод в суспензию эритроцитов (именно так удобно представлять кровь с физико-химической точки зрения) оптимального числа активированных молекул кислорода, генерируемых благодаря резонансному поглощению фотонов, вызывает повышение интенсивности мембранного транспорта и эластичности мембран до предельного уровня. Другими словами, сами эритроциты как субъекты и объекты метаболизма максимально активируются. В организме это означает восстановление кислородного снабжения тканей, нормализацию их энергетики и постепенное улучшение состояния всего организма, независимо от того, каким был диагноз заболевания. Так может быть объяснена основная особенность лазерной терапии — неспецифичность.

 

Основные физико-химические свойства эритроцитов

Эритроцит в покое, как известно, — это двояковогнутый диск диаметром около 8 мкм, толщиной в центре примерно 1 мкм, а по ободку около 2 мкм. В нем отсутствуют ядро и обычные внутриклеточные структуры, а в цитоплазме преобладает гемоглобин, обеспечивающий транспорт кислорода в ткани и обратный перенос углекислого газа. Мембрана практически нерастяжима, но сама клетка может сильно и многократно деформироваться при проходе сквозь капиллярную сеть (при ряде патологий эритроциты становятся хрупкими быстрее, чем по истечении среднего времени жизни в 120 дней — развивается гемолиз).

Обмен веществ зрелых безъядерных эритроцитов направлен на обеспечение их функции как переносчиков кислорода, а также их участия в переносе диоксида углерода. В связи с этим метаболизм эритроцитов отличается от метаболизма других клеток. Он должен прежде всего поддерживать способность эритроцита обратимо связывать кислород, для чего необходимо восстановление иона железа в составе гема.

Нормальный эритроцит способен легко изменять свою форму под действием внешних сил. Именно благодаря этому эритроциты проходят через капилляры, внутренний диаметр (около 3 мкм) которых меньше поперечника свободного эритроцита (от 7,5 до 8 мкм). Вследствие такой пластичности эритроцитов относительная вязкость крови в мелких сосудах существенно меньше, чем в сосудах, диаметр которых намного превышает 7,5 мкм. Это свойство эритроцитов связано с наличием в них гемоглобина типа А. При некоторых гемоглобинопатиях эритроциты становятся более жесткими, что ведет к нарушению кровотока. Под микроскопом хорошо заметно, как деформируются эритроциты при малейших движениях в капле крови. Как только у человека начинается недомогание, они становятся жесткими; после выздоровления они опять гибкие и эластичные. Первым на это обратил внимание еще Антони ван Левенгук, основоположник научной микроскопии. Через три столетия снова вспомнили об этом. Было выполнено много исследований. Классическим стал метод всасывания одиночного эритроцита в кварцевый капилляр. Был разработан и оптический метод, правда, с ограниченными возможностями. Выяснилось, что деликатные изменения в мембране или в биохимии эритроцита влияют на его способность к деформациям. А без них красному диску не «протиснуться» в капилляры, большинство которых по диаметру меньше его поперечника. В таком случае эритроциты в процессе кровообращения идут обходными путями через более крупные капилляры, а частично вообще не могут пройти через них. Возникает кислородный недостаток тканей (дистрофия), а при большой жесткости эритроцитов — и кислородное голодание, ведущее к атрофии (отмиранию) тканей. Для целого ряда заболеваний это создает весьма благоприятные условия с точки зрения их развития. Патологии могут быть разными, а источник их — одно и то же явление, т.е. потеря эластичности мембраны эритроцита.

Естественно предположить, что положительное воздействие на эластичность мембраны эритроцита через облучение НОИ составляет один из главных механизмов фототерапии и позволяет лечить обширный круг заболеваний, носящих преимущественно системный характер и в силу этого плохо поддающихся лечению традиционными способами [6].

Рисунок 1. Строение мембраны эритроцита.

Мембрана эритроцита (рис. 1) представляет собой пластичную молекулярную мозаику, состоящую из белков, липо- и гликопротеинов и, возможно, чисто липидных участков. Толщина ее составляет около 10 нм; она примерно в 10⁶ раз более проницаема для анионов, чем для катионов. Перенос веществ через мембрану совершается в зависимости от их химических свойств разными способами: либо гидродинамически (путем диффузии), когда вещества в виде раствора проходят через заполненные водой мембранные поры, либо, если вещества растворимы в жирах, путем проникновения через липидные участки.

 

Некоторые вещества могут взаимодействовать со встроенными в мембрану молекулами-переносчиками, образуя с ними легкообратимую связь, и в дальнейшем либо пассивно, либо в результате активного транспорта проходить через мембрану. Способность эритроцитов сопротивляться сдвиговым деформациям является доминирующей причиной формирования эластичности мембраны.

Содержание белков в эритроцитах выше, а низкомолекулярных веществ — ниже, чем в плазме. Осмотическое давление, создаваемое высокой внутриклеточной концентрацией белков, в значительной степени компенсируется малой концентрацией низкомолекулярных веществ, поэтому осмотическое давление в эритроцитах лишь немногим выше, чем в плазме: величина его как раз достаточна для обеспечения нормального тургора этих клеток. Мембрана эритроцита в принципе проницаема для малых молекул и ионов (для разных в разной степени). По причине этой проницаемости ингибирование активного транспорта ионов (активно переносятся через мембрану Nа⁺ и К⁺: Nа⁺— из клетки, а К⁺ — в клетку) приводит к снижению их трансмембранных концентрационных градиентов. Высокое внутриклеточное содержание белков, которое при этом остается постоянным, перестает компенсироваться, и осмотическое давление в эритроците возрастает.

В результате вода начинает поступать в эритроцит; это продолжается до тех пор, пока его мембрана не лопнет и гемоглобин не выйдет в плазму. Такой процесс называется осмотическим (коллоидно-осмотическим) гемолизом. Если внеклеточная жидкость лишь умеренно гипотонична, эритроциты набухают и приобретают форму, близкую к сферической (сфероциты). Напротив, в гипертонической среде они теряют воду и сморщиваются, приобретая неправильную форму (рис. 2).

 

Рисунок 2 А: нормальные эритроциты в форме двояковогнутого диска; Б: сморщенные эритроциты (эхиноциты) в гипертоническом солевом растворе.

Изучение осмотической резистентности эритроцитов в средах с нарастающей гипотоничностью показало, что при ряде заболеваний (в частности, при некоторых видах анемий) их осмотическая резистентность изменяется. Осмотический гемолиз эритроцитов наступает также в изотонических растворах веществ, легко проникающих через их мембраны. 50% эритроцитов здорового человека гемолизируются в растворе NаCl при его концентрации 4,3 г/л.

Гемолиз может наступить также в результате действия веществ, растворяющих жиры (например, хлороформа, эфира и т.п.). Эти вещества вымывают липиды из мембраны эритроцита, оставляя в нем отверстия. Гемолитическое действие мыл, сапонинов и синтетических моющих веществ обусловлено тем, что они снижают поверхностное натяжение между водной и липидной фазами мембраны. Это приводит к эмульгированию жиров, вымыванию их из мембраны и образованию в ней отверстий, через которые выходит содержимое клетки.

Высокое содержание кислорода в эритроцитах вызывает повышение скорости образования супероксидного анион-радикала, Н₂О₂ (пероксида водорода) и ОН* (гидроксил-радикала). Постоянным источником активных форм кислорода в эритроцитах является неферментативное окисление гемоглобина:

Нb(Fе²⁺)+О₂→МетHb(Fе³⁺)+О₂^-.                                       (1)

Активные формы кислорода также могут вызвать гемолиз эритроцитов. Поэтому в естественных условиях эритроциты содержат защитную ферментную систему, предотвращающую токсическое действие радикалов кислорода и разрушение мембран эритроцитов.

В отличие от перечисленных случаев гемолиза эритроцитов для нас основной интерес представляет гемолиз эритроцитов под действием низкоинтенсивного, т.е. не вызывающего температурных изменений, лазерного излучения.