Биосенсоры и биомолекулярная электроника

 

Термин «биомолекулярная электроника» появился сравнительно недавно для определения области естествознания, являющейся современным преемником биоэлектрохимии. С одной стороны, достижения электрохимии позволили выйти на молекулярный уровень исследований – сегодня представляется возможным проследить перенос одного электрона или «увидеть» биомолекулу. С другой стороны, специфика использования биологических объектов диктует необходимость расширения традиционных рамок предмета электрохимии и применения подходов биохимии, энзимологии и молекулярной биологии для модификации, иммобилизации и последующего изучения свойств биомолекул. Объединение вышеуказанных областей термином «электроника», по-видимому, выражает надежду на создание в будущем компьютеров с биологическими интеллектуальными элементами. По крайней мере, современные биологические сенсоры уже представляют собой универсальные устройства вывода информации для биокомпьютерных систем.

В настоящее время достижения биоэлектрохимии и биомолекулярной электроники ориентированы в основном на создание биологических датчиков и биоаналитических устройств. Биосенсорика, бесспорно, стала важной и независимой областью современной аналитической химии. Кроме того, как уже указывалось, биосенсоры можно рассматривать как устройства вывода информации с позиций разработки биокомпьютеров. Поэтому неудивительно, что большинство исследований в области биомолекулярной электроники ориентировано на возможность создания биосенсоров. Независимо от этого исследования в области ферментных электродов были недавно оживлены углубляющимся энергетическим кризисом, обусловившим финансирование разработок биотопливных элементов.

Вернемся, однако, к проблеме биосенсоров. Неужели в современной аналитической химии нет универсальных методов, позволяющих проводить высокочувствительный и избирательный анализ? Напротив, хромато-масс-спектрометрия превосходит биосенсорику по обоим указанным параметрам. Вспомним сенсационный скандал с отменой феноменального рекорда в беге на 100 м на Сеульской Олимпиаде. Виновник был пойман на применении допинга именно с помощью хромато - масс - спектрометра. Однако, во что обошлось устроителям приобретение, адаптация и обслуживание прибора: 6 млн долл. за сам прибор и еще несколько миллионов за обслуживание. Вряд ли рядовая лаборатория, а тем более рядовой пациент способны содержать такой прибор для одного или нескольких рутинных анализов. Кроме того, современная клиническая диагностика все с большим пристрастием рассматривает возможность имплантации, т. е. вживления датчиков для непрерывного контроля ключевых компонентов крови. Вряд ли универсальные аналитические приборы типа хромато-масс-спектрометра могут быть имплантированы.

Требования современного анализа – это чувствительность, избирательность, дешевизна, простота и экспрессность. Следует также подчеркнуть, что отсутствие стадий подготовки пробы позволит осуществлять непрерывный контроль за содержанием анализируемого вещества. Для имплантации также важной является возможность миниатюризации датчиков. Биологические сенсоры, действие которых основано на чувствительности и избирательности биологических молекул, как нельзя лучше удовлетворяют указанным требованиям. Областями применения биосенсоров и биоаналитических устройств на их основе являются: клиническая диагностика, различные области промышленности и охрана окружающей среды.

Устройство и принцип работы биоэлекгронных устройств, в том числе и биологических сенсоров, удобно рассматривать на примере последних (рис. 2.8.1). Согласно рекомендации ШРАС, биосенсором следует считать устройство, состоящее из трансдьюсера, или преобразователя сигнала, и иммобилизованного биологического элемента. На первом этапе действия биосенсора происходит «узнавание» биоэлементом специфического для него вещества из многокомпонентной смеси. Вторую стадию следует считать ключевой для работы биосенсора. Здесь необходимо организовать преобразование информации о протекании биохимической реакции в форму электрического или другого (например, оптического) сигнала. На последней стадии электрический сигнал от трансдьюсера преобразуется в нужную форму. С позиций биокомпьютеров предложенная схема является не чем иным, как путем вывода информации. Для ввода информации необходимо схему действия биосенсора пройти в обратном направлении, т.е. в ответ на электрический сигнал необходимо добиться протекания биохимической реакции. Следует, однако, отметить, что прямой и обратный путь на рис. 16.4.11 не эквивалентны и биоэлектронные устройства вывода информации далеко не всегда могут оказаться пригодными для ее ввода.

Рис. 16.4.11. Принципиальная схема действия биосенсора.

 

Биосенсоры удобно классифицировать как по типу трансдьюсеров, так и по типу элемента, осуществляющего «биоузнавание». Типы трансдьюсеров определяются физико-химическими основами их действия и позволяют разделить биологические сенсоры на следующие основные категории: электрохимические, оптические и гравиметрические. Бесспорное преимущество здесь за электрохимическими биосенсорами. Это и не удивительно, ведь электрохимические датчики преобразуют биохимический сигнал сразу в электрическую формулу, а именно электричество – это «кровь» современных компьютеров и прочих систем обработки информации. Кроме того, электрохимические датчики менее зависимы от так называемых «эффектов среды» по сравнению с оптическими устройствами. Наиболее перспективным из последних считается метод поверхностного плазменного резонанса, который, кстати, заключается в изучении характеристик электрического поля, распространяющегося от металлической поверхности в глубь исследуемого раствора. Эта задача входит в сферу интересов электрохимии и, очевидно, решаема также и с использованием ее методов.

Гравиметрическими называются датчики на основе кварцевых резонаторов, изменение резонансной частоты которых напрямую связано с изменением массы у поверхности датчика. Эта зависимость, однако, справедлива только в определенных случаях, например при осаждении металлов. Адсорбция полимеров и, в частности, биологических молекул за счет изменения вязкости и поверхностного натяжения может заключаться как в кажущемся увеличении, так и в уменьшении массы на поверхности. Известны, например, ДНК - зонды, которые в ответ на сорбцию одноцепочечного олигонуклеотида показывают уменьшение, а не ожидаемое увеличение массы.

Таким образом, поиск альтернативных физических принципов действия биосенсоров до настоящего времени не позволил создать унинереального трансдыосера, который мог бы оспорить лидирующее положение электрохимических датчиков.

Биологические датчики могут быть также классифицированы по типу биологического элемента, осуществляющего «узнавание». С позиций разработки биосенсоров важным является разделение «биологического узнавания» на продуктивное и непродуктивное (рис. 16.4.12).

 

Рис. 16.4.12. Типы биоузнавания.

 

К продуктивному узнаванию следует, в первую очередь, отнести действие ферментов. В результате связывания последних со специфическим субстратом протекает химическая реакция, приводящая к образованию продукта. Непродуктивное, но в то же время высокоизбирательное взаимодействие осуществляют следующие биологические системы: антиген - антитело, лиганд - рецептор и комплементарные одноцепочечные олигом - нуклеотиды (ДНК).

Несомненно, проще детектировать протекание химической реакции, нежели образование непродуктивных комплексов. Поэтому биосенсоры на основе ферментов занимают сегодня лидирующее положение как среди научных разработок, так и среди коммерческих сенсорных систем. Однако ферментные электроды не в состоянии охватить весь необходимый набор ключевых веществ, требующих независимого контроля, что обусловливает пристальное внимание к биологическим датчикам на основе непродуктивного биоузнавания.

Для иллюстрации научных подходов и путей практического применения биосенсоров уместно кратко вспомнить историю создания биосенсоров, а также рассмотреть одну из наших собственных разработок, наиболее завершенную и пригодную для практического применения.

Известно, что более 90% всех коммерчески значимых биосенсоров и аналитических наборов на основе ферментов основаны на действии ферментов - оксидаз. Эти ферменты окисляют свой специфический субстрат кислородом воздуха по следующей реакции:

 

При этом кислород восстанавливается до пероксида водорода. Наиболее известным примером таких ферментов является глюкозооксидаза. С использованием этого фермента, собственно, и был создан первый биосенсор.

Первое сообщение о создании биосенсора было сделано в 1962 г. на заседании Нью-Йоркской академии наук учеными Кларком и Лайонсом. Они поместили глюкозооксидазу в пространство кислородчувствительного электрода. Наблюдаемая скорость поглощения О₂ коррелировала с концентрацией глюкозы, что позволило проводить измерение последней в широком диапазоне концентраций.

Несмотря на то, что описанный глюкозный датчик вскоре лег в основу прибора, выпускаемого компанией Yellow Springs Instruments, измерение концентрации кислорода оказалось неудобным для функционирования биосенсора по следующим причинам:

·в равновесии с воздухом концентрация кислорода в водных растворах высока (0,2 ммоль), что затрудняет анализ низких концентраций анализируемых веществ;

·в реальных объектах концентрация кислорода может сильно варьировать, например в венозной крови кислорода в 10 раз меньше, чем в артериальной;

·побочный продукт реакции – пероксид водорода способен восстанавливаться электрохимически в тех же условиях, что приводит к ошибкам в анализе.

Предложенная в начале 70-х годов амперометрическая детекция пероксида водорода как принцип действия оксидазных биосенсоров позволила понизить предел обнаружения анализируемых веществ до микромолекулярного уровня. Этот принцип сопряжения электродной и оксидазной реакций является наиболее прогрессивным и сегодня. Открытие в 80-х годах медиаторных систем, которые легли в основу биосенсоров второго поколения, тем не менее не позволило добиться преимуществ в чувствительности и избирательности при анализе реальных объектов.

В 70-х годах амперометрическая детекция пероксида водорода проводилась на платиновых электродах и имела один существенный недостаток. Для осуществления детекции требовалось приложение высокого окислительного потенциала (+0,6 В относительно хлорсеребряного электрода, ХСЭ). В то же время в реальных объектах существует огромный набор веществ, которые легко окисляются на платине и прочих благородных металлах в тех же условиях. Причем скорость окисления подобных восстановителей настолько высока, что их мешающий отклик в несколько раз превышает сигнал ферментного электрода на анализируемое вещество. Уменьшить мешающее действие восстановителей можно, в первую очередь, понижая потенциал индикаторного электрода. Таким образом, важнейшей проблемой разработки оксидазных биосенсоров является осуществление низкопотенциальной детекции пероксида водорода.

До недавнего времени единственной системой, в которой пероксид водорода селективно восстанавливался в присутствии кислорода, был ферментный электрод на основе пероксидазы. Однако некоторые из указанных выше восстановителей являются субстратами фермента пероксидазы, и, таким образом, ферментный электрод не позволяет избежать их мешающего действия. К недостаткам биоэлектрохимической системы детекции Н₂О₂ следует также отнести значительно более низкую стабильность. Кроме того, биосенсоры на основе пероксидазного электрода требуют совместной иммобилизации нескольких ферментов, катализирующих последовательные реакции, что также уменьшает стабильность и воспроизводимость датчиков.

Наше внимание привлекла берлинская лазурь, или феррицианид трехвалентного железа (), как электрокатализатор. Берлинская лазурь является одним из первых координационных соединений, известных химии. Сообщения об ее открытии восходят к началу XVIII века. И тем не менее, лишь в    1978 г. была показана способность берлинской лазури образовывать электроактивные покрытия на поверхности электродов, что обусловило ее использование в качестве электрокатализатора.

Возможность избирательного определения перекиси водорода по реакции ее восстановления в присутствии кислорода на электродах, модифицированных берлинской лазурью, впервые была продемонстрирована в работах нашей группы в 1994 г. В дальнейшем, оптимизируя процедуру осаждения пленок берлинской лазури на электродах, нам удалось синтезировать селективный в широком диапазоне потенциалов электрокатализатор восстановления Н₂О₂. При нулевом потенциале (ХСЭ), являющемся оптимальным для работы ферментных электродов, регистрируемый ток восстановления Н₂О₂ в несколько сотен раз превышал ток восстановления кислорода.

Нами была исследована кинетика реакции восстановления пероксида водорода, катализируемая берлинской лазурью. В нейтральных средах схема реакции имеет следующий вид:

Для электродов, покрытых пленкой поликристалла берлинской лазури толщиной 4 – 6 нмоль-см^-2, электрохимическая константа скорости восстановления Н₂О₂ превышала 0,01 см∙с^-1, что значительно выше по сравнению со всеми известными электрокатализаторами. Например, на платине – наиболее широко используемом трансдьюсере Н₂О₂ – в нейтральных растворах электрохимическая константа в      тысячу (!) раз ниже.

Принимая во внимание высокую активность и избирательность (свойства, присущие биокатализу), для специально синтезированной берлинской лазури по нашему предложению принято название «искусственная пероксидаза».

Стабильность трансдьюсера на основе берлинской лазури всегда является объектом критики при рассмотрении возможных его практических приложений. Однако детальные исследования электрохимического осаждения пленок берлинской лазури и факторов, стабилизирующих кристаллическую структуру, позволили достичь высокой операционной стабильности модифицированных электродов даже по сравнению с другими известными трансдьюсерами Н₂О₂. В настоящее время операционная стабильность электродов составляет более 20 ч при непрерывном протоке 10~⁴ моль пероксида водорода.

На рис. 16.4.13 представлен градуировочный график сенсора на пероксид водорода в проточно-инжекционной системе. Очевидна возможность определения Н₂О₂ в сверхмалых концентрациях 10⁷ моль, что на порядок ниже, чем при использовании других трансдьюсеров. Чувствительность датчика составила              0,6 А-моль^-1 ∙см^-2, что на один - два порядка выше, чем для всех известных систем.

Рис. 16.4.13.. Градуировочный график определения пероксида водорода на электроде, модифицированном берлинской лазурью

 

Схема биосенсора на основе электродов, модифицированных берлинской лазурью, представлена на рис. 16.4.14. Ферментный электрод конструируется путем иммобилизации фермента или группы ферментов на поверхности электрода. Для примера на рис. 16.4.14 представлен глюкозочувствительный электрод. Схема его действия состоит в следующем. Специфический субстрат (глюкоза) окисляется кислородом воздуха в активном центре фермента. Побочным продуктом реакции является пероксид водорода, который детектируется трансдьюсером на основе берлинской лазури.

Объектом критики описанных биологических датчиков являлась и, как ни странно, суперчувствителъность берлинской лазури. Дескать, все равно чувствительность устройства будет определяться скоростью ферментативной реакции и высокая чувствительность трансдьюсера является избыточной.

Удалось разработать новый подход к иммобилизации ферментов на поверхности модифицированных электродов, который опровергает подобное предположение. Суть подхода заключается в иммобилизации ферментов в пленки водонерастворимых полиэлектролитов, и в частности, полиэлектролита Nation, из водноорганических смесей с высоким (90%) содержанием органического растворителя. Полученный в результате глюкозный датчик (в соответствии со схемой, представленной на рис. 16.4.14) в проточно-инжекционном режиме позволяет определять глюкозу до концентраций 10'" моль и обладает чувствительностью, которая оказалась всего в 4 раза (!) ниже по сравнению с использованным трансдьюсером пероксида водорода.

 

Рис. 16.4.14. Схема глюкозного биосенсора.

 

Для доказательства того, что описанный пример не является случайным, нами был сделан по аналогии датчик на глютамат на основе фермента глютаматоксидазы. Отметим, что активность фермента глютаматоксидазы на два порядка ниже по сравнению с глюко - зооксидазой. В проточно - инжекционном режиме биологический датчик позволяет количественно определять до 10^-7 моль глютамата, что на порядок ниже показателей современных биосенсоров. Чувствительность при этом составила 0,2 А∙моль^-1 см^-2, что приблизительно на один порядок выше значений, полученных для лучших из известных ферментных электродов. Очевидно, что чувствительность глютаматного биосенсора всего в 3 раза меньше чувствительности использованного трансдьюсера пероксида водорода (берлинской лазури).

Таким образом, усовершенствованный метод иммобилизации позволяет добиться высокой чувствительности биосенсора, которая лишь в 3 – 4 раза ниже по сравнению с чувствительностью использованного трансдьюсера. Объединение двух предложенных подходов – электросинтеза суперчувствительного трансдьюсера пероксида водорода (берлинской лазури) и нетрадиционного метода иммобилизации ферментов позволяет получить лучшие на сегодняшний день биосенсоры.

Каковы области применения полученных датчиков? Оказывается, пероксид водорода сам по себе является важным объектом контроля. Избыточные концентрации пероксида водорода, появляющиеся в дождевых и грунтовых водах в результате выбросов промышленности, и особенно атомных станций, опасны для экологии и здоровья людей. Кроме того, пероксид водорода используют для дезинфекции плавательных бассейнов и зачастую питьевой воды. Пероксид водорода и супероксидные радикалы, которые легко детектировать с помощью биосенсора, аналогичного описанным, являются ключевыми веществами нормального обмена веществ организма. Нарушение так называемого оксидантного баланса сопровождает такие тяжелые заболевания, как атеросклероз, сахарный диабет, потеря иммунитета и пр.

Биосенсоры на основе ферментов - оксидаз находят все большее применение в самых различных областях. В пищевой промышленности – это и анализ сырьевых продуктов (свежесть, качество), и контроль различных ферментации, в том числе в пивоварении и виноделии, и контроль качества конечных продуктов, в частности на содержание искусственных пищевых добавок. В пищевой и текстильной промышленности наряду с охраной окружающей среды биологические сенсоры способны содействовать выявлению опасных для здоровья химических веществ. Наконец, в клинической диагностике контроль за содержанием ключевых компонентов обмена веществ крови и мозговой жидкости может проводиться с помощью биосенсоров. Описанные биосенсоры легко подвергаются миниатюризации и поэтому могут быть имплантированы в организм для непрерывного анализа. Одним из важнейших направлений современной клинической диагностики является неинвазивная диагностика, т.е. анализ, не предусматривающий отбора крови. И в этом направлении биосенсоры с их высокими чувствительностью и избирательностью призваны сыграть ключевую роль.