Витамины группы В – тиамин бромид, рибофлавин, цианокобаламин. Методы анализа, хранение, применение

Лекарственное вещество	Химическая структура	Описание
Thiamine Bromide— тиамина бромид	4-метил-5b-оксиэтил- N - (2`-метил-4`-амино-5`-метилпиримидил)-тиазолий бромида гидробромид полугидрат	Белый или белый со слегка желтоватым оттенком кристаллический порошок со слабым характерным запахом, напоминающим запах дрожжей
Thiamine Chloride— тиамина хлорид	4-метил-5b-оксиэтил- N - (2`-метил-4`-амино-5`-метилпиримидил)-тиазолий хлорида гидрохлорид	Белый кристаллический порошок со слабым характерным запахом, напоминающим запах дрожжей. Гигроскопичен

 

Подлинность солей тиамина можно подтвердить по ИК- и УФ-спектрам. ИК-спектр тиамина хлорида, полученный после прессования в таблетке из бромида калия в области 4000-700 см^–1 должен полностью совпадать с рисунком спектра, прилагаемым к ФС.

УФ-спектр 0,0015%-ного раствора тиамина бромида в 0,1 М растворе хлороводородной кислоты в области 220-280 нм имеет один максимум поглощения при 246 нм, а 0,0025%-ного водного раствора тиамина хлорида — два максимума поглощения при 237 и 262 нм.

Кроме измерений ИК- и УФ-спектров для испытания подлинности используют химические реакции: окисления в щелочной среде, деструкции при сплавлении со щелочами (до образования сульфид-ионов), образования азокрасителя за счет подвижного атома водорода в положении 2, нейтрализации связанных кислот, обнаружения бромид- или хлорид-ионов, реакций с «осадительными» реактивами.

 

Идентифицируют обе соли с помощью реакции, основанной на окислении тиамина в щелочной среде. Эта реакция известна под названием тиохромной пробы. Общая ее схема:

 

Тиохром из водных растворов извлекают бутиловым или изоамиловым спиртом. Полученные спиртовые растворы при ультрафиолетовом облучении (365 нм) имеют характерную синюю флуоресценцию, исчезающую при подкислении и вновь возникающую при подщелачивании. Реакцию образования тиохрома используют для количественного флуориметрического определения тиамина.

Тиамина бромид дает характерные реакции на бромиды, а тиамина хлорид — на хлориды. Реакция образования свободного брома под действием хлорамина в солянокислой среде (желто-бурое окрашивание хлороформного слоя) рекомендована ФС для отличия тиамина бромида от тиамина хлорида. При действии на соли тиамина реактивом Несслера появляется желтое окрашивание, которое вследствие восстановления до металлической ртути переходит в черное. При добавлении двух капель 15%-ного раствора гидроксида натрия к 0,1%-ному раствору соли тиамина появляется желтое окрашивание. При сплавлении с кристаллическими едкими щелочами тиамин разрушается с образованием сульфидов, которые легко обнаружить с помощью раствора нитропруссида натрия (красно-фиолетовое окрашивание).

Как и другие третичные амины, тиамин при нагревании на водяной бане с уксусным ангидридом и кристаллами лимонной кислоты приобретает красное окрашивание. При пиролизе тиамина вследствие наличия в его молекуле первичной аминогруппы происходит конденсация:

 

2R-NH₂ ¾® R-NH-R + NH₃

 

Благодаря этому при нагревании тиамина с диметилоксалатом в присутствии тиобарбитуровой кислоты образуется вещество красного цвета.

Основание тиамина из растворов количественно осаждается некоторыми осадительными (общеалкалоидными) реактивами (кремневольфрамовой, фосфорновольфрамовой, пикриновой, пикролоновой кислотами и др.). Фосфорновольфрамовая кислота осаждает тиамин из растворов солей. В образовавшемся фосфорновольфрамате затем обнаруживают наличие серы и галогена. Тиамин можно обнаружить по образованию белого осадка с насыщенным раствором хлорида ртути (II), красно-коричневого осадка с 0,02 М раствором иода, желтого осадка пикрата (температура плавления 206–208°C) с насыщенным раствором пикриновой кислоты. Реакция осаждения кремневольфрамовой кислотой рекомендуется для гравиметрического и фотонефелометрического определения солей тиамина. Кремневольфрамат тиамина имеет состав: 2[C₁₂H₁₇BrN₄OS]×SiO₂×12WO₃.

Сущность количественного гравиметрического определения тиамина бромида состоит в нагревании смеси водного раствора навески, концентрированной хлороводородной кислоты и 10%-ного раствора кремневольфрамовой кислоты. Образовавшийся осадок отделяют, промывают на фильтре горячей разбавленной хлороводородной кислотой, затем водой и ацетоном. Все операции выполняют на предварительно высушенной до постоянной массы воронке, которую вместе с осадком сушат, охлаждают в эксикаторе и взвешивают. Масса осадка, умноженная на коэффициент 0,25, соответствует количеству тиамина бромида.

Тиамина хлорид количественно определяют аналогично гравиметрическим методом или методом неводного титрования. В качестве растворителя используют муравьиную кислоту, безводную уксусную кислоту (5:65), титрантом служит 0,1 М раствор хлорной кислоты. Титруют в присутствии ацетата ртути (II), устанавливая эквивалентную точку потенциометрически со стеклянным и каломельным или хлорсеребряным электродами.

 

Тиамина бромид количественно определяют также в водной среде способом, основанным на нейтрализации гидробромида и последующим аргентометрическим титрованием суммы бромид-ионов:

 

 

Наиболее широко применяют алкалиметрический метод определения тиамина хлорида и тиамина бромида с использованием индикаторов бромтимолового синего или фенолфталеина (титрант 0,1 М раствор гидроксида натрия). Соли тиамина можно также определить по хлорид- и бромид-иону аргентометрически методом Фаянса с использованием в качестве индикатора бромфенолового синего в присутствии разведенной уксусной кислоты (для создания необходимого рH среды).

Известен меркуриметрический метод определения солей тиамина в азотнокислой среде с индикатором дифенилкарбазидом или дифенилкарбазоном. Титрантом служит 0,1 М раствор нитрата ртути (II):

 

[C₁₂H₁₇N₄OS]⁺Br^– × HBr + Hg(NO₃)₂ ¾¾® HgBr₂ + [C₁₂H₁₇N₄OS]⁺NO₃^– × HNO₃

 

Соли тиамина хранят в герметически закрытой таре, предохраняющей от действия света, без контакта с металлами. Недопустимость такого контакта обусловлена возможностью постепенного разложения тиамина до дигидротиамина:

 

 

Менее устойчив при хранении тиамина хлорид, который даже в темноте постепенно разлагается, особенно во влажной атмосфере. При повышении температуры разрушение ускоряется. Нейтральные и щелочные растворы разлагаются быстро, особенно при контакте с воздухом. Растворы с рH 4,0 и менее очень медленно теряют активность.

Соли тиамина назначают при нарушениях функции нервной системы. Вводят внутрь по 0,005–0,01–0,02 г или внутримышечно по 0,5–1,0 мл 2,5%- или 5%-ного раствора тиамина хлорида (3%-ные или 6%-ные растворы тиамина бромида).

Лекарственное вещество	Химическая структура	Описание
Riboflavin— рибофлавин	6,7-диметил-9-(D-1-рибитил)-изоаллоксазин	Желто-оранжевый кристаллический порошок со слабым специфическим запахом. На свету неустойчив. Удельное вращение от –115 до –135° (0,5%-ный раствор в спиртовом растворе гидроксида калия)
Riboflavin–mononucleotide— рибофлавина-мононуклеотид	натриевая соль 6,7-диметил-9-(1-D-рибитил)изоаллоксазин-5`-фосфата дигидрата	Желто-оранжевый кристаллический порошок, без запаха. На свету неустойчив. Гигроскопичен. Удельное вращение от +37 до +43° (1,5%-ный раствор в 5 М растворе хлороводородной кислоты)

 

Рибофлавин медленно растворим в воде (1 г в 15000-25000 мл), а рибофлавина-мононуклеотид растворим в воде. Оба практически нерастворимы в этаноле и хлороформе. Рибофлавин растворим в растворах кислот и щелочей, т.к. является амфотерным соединением. Его кислотные свойства обусловлены наличием подвижного атома водорода имидной группы, а основные — наличием нескольких гетероциклических атомов азота.

Идентифицировать рибофлавин можно по ИК-спектру, который должен соответствовать спектру, полученному с его стандартным образцом, или спектру сравнения (МФ). Для испытаний производных изоаллоксазина используют химические реакции, основанные на окислительно-восстановительных свойствах сопряженных двойных связей, окислении и этерификации рибитильной части молекулы, комплексообразовании, гидролизе, наличии в молекуле третичного атома азота, иона натрия и связанной фосфорной кислоты.

Подлинность рибофлавина устанавливают по характерной яркой зеленовато-желтой окраске и интенсивной зеленой флуоресценции водного раствора (в ультрафиолетовом излучении). Флуоресценция исчезает при добавлении растворов хлороводородной кислоты или щелочи. Если к водному раствору рибофлавина прибавить гидросульфит натрия (сильный восстановитель), то окраска и флуоресценция исчезают вследствие образования лейкорибофлавина (химизм см. выше). Свойство флуоресцировать используют для флуориметрического определения рибофлавина.

Желто-зеленую флуоресценцию наблюдают в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм у водного 0,1%-ного раствора рибофлавина-мононуклеотида. Она исчезает при добавлении 1%-ного раствора гидроксида натрия или разведенной хлороводородной кислоты.

Рибофлавина-мононуклеотид в отличие от рибофлавина дает положительную реакцию на ион натрия и на фосфаты, которые образуются после кипячения в течение 5 мин раствора в концентрированной азотной кислоте. Кроме того, определяют (без разрушения) содержание примеси фосфорной кислоты (не более 0,7%) спектрофотометрическим методом, используя в качестве реактива молибдат аммония при длине волны 740 нм.

В качестве реактива используют также концентрированную серную кислоту, от которой при смачивании крупинка рибофлавина приобретает вишнево-красное окрашивание. Раствор нингидрина при кипячении в щелочной среде образует в присутствии рибофлавина зеленую окраску. Как азотсодержащее органическое основание, рибофлавин дает положительную реакцию с реактивом Драгендорфа и другими общеалкалоидными (осадительными) реактивами. С солями металлов (серебра, кобальта, меди, ртути и др.) рибофлавин образует нерастворимые окрашенные комплексные соединения. Например, с раствором нитрата серебра — оранжево-красного, переходящего в красный, а с солями ртути (II) — оранжевого цвета. Эти реакции используют для фотоколориметрического определения рибофлавина в лекарственных формах.

В рибофлавине и рибофлавина-мононуклеотиде устанавливают допустимое содержание примеси люмифлавина путем извлечения его хлороформом. Затем либо измеряют его оптическую плотность относительно хлороформа при длине волны 440 нм (рибофлавин), либо сравнивают окраску хлороформного извлечения относительно раствора дихромата калия определенной концентрации (рибофлавина-мононуклеотид).

Для качественного и количественного анализа применяют спектрофотометрию в УФ-области. Все испытания выполняют, защищая испытуемые лекарственные вещества от попадания прямого солнечного света. В водных растворах рибофлавин имеет 4 максимума поглощения (223, 267, 370 и 445 нм). Используя в качестве растворителя воду с добавлением уксусной кислоты и ацетата натрия, выполняют спектрофотометрическое определение рибофлавина при длине волны 267 нм. Тот же растворитель берут для растворения навески рибофлавина-мононуклеотида в мерной колбе и последовательного выполнения нескольких испытаний. Подлинность подтверждают по УФ-спектру полученного раствора рибофлавина-мононуклеотида, который имеет три максимума светопоглощения при 266, 373 и 445 нм. И в том же растворе спектрофотометрическим методом количественно определяют при длине волны 445 нм содержание рибофлавина-мононуклеотида. В аналогичных условиях проводят количественное определение рибофлавина (ФС). Расчет выполняют по удельному показателю поглощения (328) рибофлавина при длине волны 444 нм, а затем умножают на коэффициент пересчета. МФ рекомендует для этой цели использовать стандартный образец.

Растворы, приготовленные для количественного спектрофотометрического определения, используют для установления в рибофлавине допустимого содержания светопоглощающих примесей. С этой целью измеряют оптическую плотность указанных растворов рибофлавина в максимумах при длинах волн 267 нм, 373 нм, 444 нм. Отношение оптических плотностей при 373 нм и 267 нм должно быть в пределах от 0,31 до 0,33, а при 444 нм и 267 нм — от 0,36 до 0,39. Допустимое содержание поглощающих примесей в рибофлавина-мононуклеотиде устанавливают, измерив оптическую плотность его раствора при длинах волн 373 нм, 266 нм и 445 нм. Отношение этих величин при 373 и 445 нм должно быть от 0,83 до 0,86, а при 266 и 445 нм — от 2,5 до 2,75.

Способы количественного определения титриметрическими методами основаны на использовании кислотно-основных и окислительно-восстановительных свойств.

Для количественного определения применяют алкалиметрическое определение рибофлавина после его реакции с нитратом серебра, а также цериметрию с иодометрическим окончанием и метод Кьельдаля (содержание азота 14,5– 15,2%). Предполагают, что под действием нитрата серебра происходит замещение водорода иминогруппы ионом серебра с выделением эквивалентного количества азотной кислоты, которую оттитровывают щелочью (индикатор бромтимоловый синий). При цериметрическом определении 0,02 М раствором сульфата церия (IV) окисляют рибофлавин при кипячении (в течение 1 минуты). Затем после охлаждения добавляют иодид калия и титруют выделившийся иод.

Селективными, позволяющими количественно определять содержание рибофлавина, являются методики, базирующиеся на реакциях по рибитильному радикалу, влияющему на витаминную активность.

Одна из таких методик основана на окислении рибофлавина 0,02 М раствором периодата калия в нейтральной среде при комнатной температуре с образованием муравьиной кислоты. Ее количество эквивалентно взятому на определение рибофлавину:

 

Выделившуюся муравьиную кислоту оттитровывают алкалиметрическим методом:

 

2HCOOH + 2NaOH → 2HCOONa + 2H₂O

 

Второй способ определения рибофлавина по рибитильной части молекулы основан на этерификации концентрированной серной кислотой. При этом за счет гидроксильных групп происходит образование моно-, ди-, три-, тетрасульфокислотных эфиров. Затем потенциометрическим титрованием раствором гидроксида калия устанавливают избыток серной кислоты. Реакция протекает стехиометрически в соотношении 1:3.

Рибофлавин необходимо хранить в хорошо укупоренных банках оранжевого стекла, учитывая его свойство легко окисляться и разлагаться под действием света с образованием биологически неактивных люмихрома и люмифлавина. Рибофлавина-мононуклеотид более устойчив, поэтому его хранят в сухом, защищенном от света месте.

Рибофлавин восполняет недостаток витамина B₂ в организме. Особенно он важен для нормальной функции зрения. Назначают внутрь в таблетках и драже по 0,005-0,01 г при гипо- и авитаминозе, различных глазных заболеваниях, длительно не заживающих ранах и язвах, лучевой болезни, болезни Боткина и т.д. Рибофлавина мононуклеотид при тех же заболеваниях вводят внутримышечно по 1 мл 2%-ного раствора, а в офтальмологии применяют 1%-ные растворы.

Лекарственное вещество	Химическое название	Описание
Cyanocobalamin— цианокобаламин (Витамин B12)	Coa-[a(5,6-диметилбензимидазолил)]-Cob-цианокобамид	Кристаллы или кристаллический порошок темно-красного цвета, без запаха. Гигроскопичен. Разлагается при температуре 200 °C
Hydroxocobalamin— гидроксокобаламин (Оксикобаламин)	Coa-[a(5,6-диметилбензимидазолил)]-Cob-гидроксокобамида гидрохлорид	Кристаллы или кристаллический порошок темно-красного цвета, без запаха. Гигроскопичен.
Cobamamide— кобамамид	Coa[a-(5,6-диметилбензимидазолил)]-Cob-аденозилкобамид	Темно-красный кристаллический порошок без запаха. Гигроскопичен.

 

Цианокобаламин и его аналоги сходны между собой по физическим свойствам. Они представляют кристаллические гигроскопичные вещества темно-красного цвета (табл. 73.1). Окраска обусловлена присутствием в молекулах атома кобальта (III). Цианокобаламин и кобамамид умеренно растворимы в воде (цианокобаламин медленно), гидроксокобаламин растворим в воде. В этаноле цианокобаламин умеренно растворим, гидроксокобаламин мало растворим, а кобамамид практически нерастворим. Гидроксокобаламин практически нерастворим в эфире, а цианокобаламин в эфире и хлороформе.

В основе испытаний кобаламинов лежат физико-химические свойства, обусловленные наличием в их молекулах атома кобальта.

Цианокобаламин можно обнаружить капельным методом. Если к водному раствору 0,5 мг цианокобаламина в пробирке прибавить 10 мг щавелевой кислоты и осторожно нагреть, то на фильтровальной бумаге, смоченной смесью раствора ацетата меди и бензидина, которой накрыта пробирка, появляется синее пятно.

Цианокобаламин и его аналоги можно идентифицировать по атому кобальта. Поскольку они представляют собой довольно прочные комплексные соединения, их необходимо предварительно подвергнуть минерализации. Ее можно осуществить в присутствии азотной кислоты. Полученный при этом нитрат кобальта образует окрашенный продукт с азокрасителем пиридоксина в водно-ацетоновой среде при рH 7 с максимумом поглощения при 515–520 нм.

Обнаружить кобальт (по ФС) можно также после сплавления цианокобаламина или гидроксокобаламина с гидросульфатом калия. Затем открывают ион кобальта после нейтрализации раствором гидроксида натрия (по фенолфталеину), прибавления ацетата натрия и уксусной кислоты. Реакция основана на образовании имеющего красный цвет внутрикомплексного соединения кобальта с нитрозо-R-солью (динатриевой солью 1-нитрозо-2-нафтол-3,6-дисульфокислоты):

 

Окраска сохраняется после добавления хлороводородной кислоты и кипячения в течение 1 мин.

Ион кобальта можно также обнаружить после выпаривания и прокаливания 0,25 мг цианокобаламина с 10 мг сульфата калия и 2 каплями 15%-ной серной кислоты. К остатку прибавляют насыщенный раствор роданида аммония в ацетоне; появляется сине-зеленое окрашивание:

 

Co²⁺ + 2NH₄NCS ¾® Co(NCS)₂ + 2NH₄⁺

 

Для испытания подлинности и чистоты, а также количественного определения цианокобаламина и его аналогов используют УФ-спектрофотометрию.

При испытании подлинности устанавливают наличие максимумов поглощения 0,002%-ного водного раствора цианокобаламина при 278, 361 и 550 нм. Устанавливают также отношение величин оптической плотности при 361 нм и 278 нм (1,7–1,88), а также при 361 нм и 550 нм (3,15–3,40). Указанные параметры делают более надежной идентификацию цианокобаламина в УФ-области. Они также используются при испытании цианокобаламина на чистоту.

Для этой же цели, при испытании на посторонние примеси (допускается не более 4%) применяется метод ТСХ. Его выполняют на пластинках Силуфол УФ-254. Хроматографируют восходящим методом различные количества цианокобаламина (50; 0,5; 1,0; 1,5 мкг) в системе растворителей: хлороформ-метанол-10%-ный раствор аммиака (15:10:3). Сравнивая величину пятен и интенсивность их красной окраски, делают заключение о наличии посторонних примесей.

Растворы кобамамида в 0,03 М растворе ацетата натрия имеют максимумы поглощения при 260 и 375 нм, а также максимум в видимой области спектра при 522 нм. Если 0,002%-ный раствор кобамамида облучить светом от лампы накаливания (100 Вт) в течение 30 мин, то по окончании фотолиза раствор приобретает характерный максимум поглощения при 351 нм. Для установления наличия поглощающих примесей измеряют оптическую плотность 0,002%-ного раствора в том же растворителе в максимумах при длинах волн 260, 280, 375 и 522 нм. Величины отношений оптических плотностей должны быть при длине волны 280 нм к 260 нм от 0,6 до 0,65; при 375 нм к 260 нм от 0,28 до 0,33; при 522 нм к 260 нм от 0,21 до 0,26.

Растворенный в ацетатном буфере (рH 4,5) гидроксокобаламин имеет в области 250-550 нм три максимума поглощения при 274, 351 и 525 нм. Отношение поглощения при 525 нм к таковому при 351 нм от 0,3 до 0,35, а при 274 нм к 351 нм от 0,75 до 0,85. Для отличия от цианокобаламина используют специфичную на гидроксокобаламин реакцию с раствором карбоната лития в пикриновой кислоте. Выполняют также реакцию на хлориды.

При испытании гидроксокобаламина на чистоту устанавливают предельное содержание неидентифицированных окрашенных примесей (не более 3%), используя для этой цели пластинки Силуфол УФ-254. Определяют также содержание цианокобаламина и других кобаламинов (не более 3%) и наличие других примесей (не более 3%). Методом ГЖХ определяют содержание остаточного растворителя — ацетона (не более 0,4%).

Количественно определяют цианокобаламин в водных растворах при длине волны 361 нм, параллельно измеряя оптическую плотность ГСО цианокобаламина в тех же условиях. Расчет содержания цианокобаламина (не менее 95%) выполняют по оптической плотности ГСО. Количественное определение гидроксокобаламина выполняют спектрофотометрическим методом в ацетатном буфере при длине волны 351 нм. Содержание рассчитывают по предварительно установленному удельному показателю поглощения безводного гидроксокобаламина. Аналогичный способ лежит в основе спектрофотометрического количественного определения кобамамида (ФС). Растворителем служит буферный раствор (рH 2). Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при длине волны 459 нм. Содержание кобамамида вычисляют по удельному показателю поглощения (55).

Известен микробиологический метод определения цианокобаламина с помощью культуры E.coli, основанный на определении зон стимуляции тест-микроорганизма. Однако этот метод длителен, требует чистой культуры, сложных питательных сред, асептических условий. Учитывая, что около 4,5% молекулярной массы цианокобаламина составляет элемент кобальт, для определения может быть использован также атомно-абсорбционный метод.

Цианокобаламин хранят, учитывая гигроскопичность, в хорошо укупоренной таре, соблюдая асептические условия, ибо микрофлора поглощает витамин B₁₂. Он разрушается от действия окислителей и восстановителей. Необходимо также предохранять от действия света. Водные растворы цианокобаламина устойчивы при рH 4,0–6,0. Гидроксокобаламин хранят в плотно укупоренной таре, предохраняющей от действия света, в сухом прохладном месте (при температуре не выше +10°C). Он очень гигроскопичен и даже в темноте постепенно разлагается во влажной атмосфере, особенно при повышенной температуре. Кобамамид хранят в сухом, защищенном от света месте, при температуре не выше +5°C.

Кобамамид предотвращает дегенеративные изменения нервной ткани и проявляет антианемическое действие. Цианокобаламин назначают для лечения злокачественного малокровия, различных видов анемии, при лучевой болезни, заболеваниях печени, нервной системы, кожных и других заболеваниях. Вводят цианокобаламин внутримышечно, подкожно, внутривенно по 100–200 мкг, реже до 500 мкг. Показания для применения гидроксокобаламина те же, что и у цианокобаламина, выпускают его в ампулах по 1 мл 0,01, 0,05 и 0,1%-ные растворов (соответственно 100, 500 и 1000 мкг в 1 мл). Кобамамид проявляет также анаболическое действие. Его применяют при B₁₂-дефицитных анемиях, в комплексной терапии при лечении заболеваний печени и периферической нервной системы. Назначают внутрь, внутривенно и внутримышечно (по 0,0005–0,001 г в сутки).