Введение гена в вектор и клонирование

Методы получения генов

1. Химический синтез. Расшифровав последовательность аминокислот в белке, и используя генетический код, определяют последовательность нуклеотидов ДНК на участке гена и производят его синтез из нуклеотидов при помощи фермента полимераза-1. Таким путем в 1969 г. Корана впервые синтезировал участок молекулы ДНК, кодирующий аланиновую т-РНК, а в 1977 г. Бойер синтезировал ген соматостатина человека, а затем и ген инсулина. В 1977 г. В. Гилбертом, а также Ф. Сэнгером был предложен метод секвенирования, т.е. распознавания последовательности нуклеотидов в фрагментах нуклеиновых кислот. Метод химического синтеза генов оказался трудоемким и малоэффективным. Затем появились быстрые и простые методы синтеза сравнительно длинных олигонуклеотидов с определенной, заранее заданной, последовательностью нуклеотидов. Теперь довольно легко можно синтезировать последовательность до 100 нуклеотидов. Автоматизация этих процессов еще более облегчает и ускоряет синтез.

2. Рестрикционный метод, или получение генов с помощью специфических эндонуклеаз - рестриктаз. Эти ферменты открыты в 1953 г. у бактерий. С помощью рестриктаз расщепляют ДНК бактерий другого штамма или клетки-хозяина. К настоящему времени из разных микроорганизмов выделено более тысячи различных рестриктаз; в генетической инженерии используется около 200. Рестриктазы гидролизируют ДНК строго по определенным специфическим последовательностям, называемым сайтами рестрикции. Каждая из рестриктаз узнает свой сайт рестрикции и разрезает ДНК либо внутри сайта, либо в непосредственной близости от него. Обозначение растриктаз складывается из начальных букв латинского названия вида бактерии, из которой выделен фермент, и дополнительного обозначения, т.к. из бактерий одного вида может быть выделено несколько различных рестриктаз: Escherichia coli - Eco R1, Eco RV; Thermus aguaticus - Tag 1. Из нескольких типов рестриктаз в генной инженерии часто используются рестриктазы двух типов, которые узнают определенную последовательность ДНК и гидролизуют ее внутри последовательности сайта рестрикции.

Фрагменты ДНК, имеющие одинаковые «липкие» концы, могут соединяться друг с другом с помощью ДНК-лигазы, при этом сайт рестрикции восстанавливается. Фрагменты с «липкими» концами наиболее удобны для создания рекомбинантных ДНК. 31

Однако рестриктазы не «выстригают» полностью ген и его нужно либо достраивать химическим путем, либо отщеплять лишние нуклеотидные последовательности.

3. Ферментативный синтез генов стал возможен после открытия фермента обратной транскриптазы или ДНК-ревертазы (Г. Тёмин, Мизутани, 1970), выделенной из онкогенных вирусов. Ревертазы могут синтезировать комплементарную цепь ДНК (к-ДНК) на РНК-матрице. При помощи ДНК-зонда (одноцепочечная меченая молекула ДНК, комплементарная какому-либо участку и-РНК) находят информационную (матричную) РНК. Практически все эукариотические и-РНК содержат на своем 3' конце последовательность, состоящую из остатков аденина (поли А-последовательность), которая присоединяется к и-РНК в результате сплайсинга. Для начала реакции синтеза ДНК-ревертазе нужна затравка в виде небольшого двухцепочечного отрезка. Эту функцию выполняют короткие олигонуклеотиды из 18-20 тиминовых остатков (поли д-Т), которые соединяются по принципу комплементарности с поли А-последовательностью и-РНК. В результате образуется гибридная и-РНК - к-ДНК молекула, причем на конце у нее будет синтезироваться короткий отрезок двухцепочечной ДНК - шпилька. Шпилька служит затравкой для синтеза второй комплементарной цепи ДНК, осуществляющегося уже ферментом ДНК-полимеразой (см. рис.). Цепь и-РНК гидролизуется РНК-азой, а шпилька (одноцепочечная ДНК) - эндонуклеазой S1. В результате получится двухцепочечная молекула к-ДНК, соответствуюшая структурному гену, с которого транскрибировалась исходная молекула и-РНК. К полученной ДНК присоединяют «липкие» концы для встраивания в плазмиду и размножения гена. Подобная схема была использована для получения генов, кодирующих инсулин, гормона роста, интерферона, альбумина, иммуноглобулинов и др. белков, производство которых уже налажено в промышленных масштабах. Возможно и соединение фрагментов ДНК с «тупыми» концами за счет действия ДНК-лигазы, но эффективность такого «сшивания» на порядок ниже.

Схема синтеза двуцепочечной к-ДНК на м-РНК (и-РНК)

Разработаны методы соединения фрагментов ДНК с «липкими» и «тупыми» концами, что позволяет создавать рекомбинантные молекулы ДНК и в тех случаях, если даже эти фрагменты были получены с использованием различных рестриктаз. Под рекомбинантными ДНК понимают ДНК, образованные объединением in vitro двух и более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников.

4. Химико-ферментативный синтез генов применяется наиболее часто. Химическим путем синтезируют олигонуклеотиды: линкеры, адаптеры, праймеры, промоторы, а гены синтезируют ферментативным методом. Линкеры (англ. «Iink» - соединять) - короткий двухцепочечный олигонуклеотид, содержащий сайты узнавания для ряда рестриктаз. Адаптеры - это линкеры, содержащие более одного сайта узнавания рестриктазой, он предназначен для соединения фрагментов с несовместимыми концами. Праймеры - короткие одноцепочечные фрагменты, комплементарные началу или концу гена. Промотор (80-10 нуклеотидов) - фрагмент ДНК, узнаваемый РНК-полимеразой.

Введение гена в вектор и клонирование

Очень важной операцией в генной инженерии является введение в клетку и стабильное поддержание генетической информации, содержащейся в рекомбинантных молекулах ДНК. ДНК, введенная в бактериальную клетку, гидролизуется ее ферментами до нуклеотидов. Если даже ДНК «выживает» в клетке, то она утрачивается в процессе деления. Для того, чтобы рекомбинантная ДНК стала составной частью генома клетки, она должна либо интегрироваться в хромосому и реплицироваться за ее счет, либо быть способной к автономной репликации. Это достигается при помощи векторных молекул (векторов). Рекомбинантные ДНК привносят в организм реципиента новые свойства: синтез аминокислот и белков, гормонов, ферментов, витаминов и др. Вектор - молекула ДНК, способная переносить в клетку чужеродную ДНК и обеспечивать там ее размножение (клонирование) или реже - включение в геном. К векторам предъявляются определенные требования. Кольцевая молекула ДНК может реплицироваться в клетках, если содержит ДНК-репликатор (оri-последовательность). Вектор должен содержать уникальные сайты рестрикации для нескольких рестриктаз, обладать определенной емкостью и не выбрасывать встроенный фрагмент; маркерный ген, облегчающий отбор клеток, несущих вектор, чтобы ген экспрессировался (получался продукт, синтезированный по информации введенного гена); специфические для данной клетки промоторы и терминаторы («стоп»-кодоны) транскрипции.

В свою очередь, РНК-транскрипт будет транслироваться, если РНК содержат сигналы связывания с рибосомами и кодоны инициации и терминации трансляции. Встраивание чужеродного фрагмента ДНК в геном вектора осуществляется в два этапа: сначала ДНК вектора разрезается с помощью рестриктазы, а затем в них встраивается чужеродный фрагмент.

Сшивание генов (фрагментов) ДНК по «липким» концам, т.е. взаимокомплементарным участкам длиной из 4-6 нуклеотидов, достаточно легко осуществляется ферментом ДНК-лигазой (лигирование ДНК) с образованием ковалентной фосфодиэфирной связи между соседними нуклеотидами:

При отсутствии комплементарных «липких» концов у сшиваемых фрагментов их достраивают при помощи линкеров (или переходников). В качестве векторов используют, как правило, плазмиды, бактериофаги, мобильные элементы, вирусы животных. В настоящее время создано большое число векторов, и по профилю использования их можно подразделить на несколько типов.

1. Векторы для клонирования фрагмента ДНК. Для этого используются чаще бактериальные плазмиды и фаги.

2. Экспрессионные векторы. Их используют для анализа конкретных последовательностей генов и их белковых продуктов, а также наработок конкретного белка. Экспрессионные векторы для эукариотических организмов всегда содержат так называемую экспрессионную кассету, состоящую из промотора, способного работать в данном организме, и сайта полиаденилирования.

3. Векторы для трансформации. Используются для введения чужеродного фрагмента ДНК в геном реципиента. Обычно такие векторы содержат специфические последовательности, способствующие интеграции в геном. Современные векторные системы часто бывают полифункциональными, совмещая несколько функций в одном векторе. Большинство из них сконструировано при помощи методов генной инженерии. В качестве векторов прокариот используют плазмиды, фаги и их комбинации. Плазмиды - это бактериальные внехромосомные двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК с вариабельными молекулярными массами (1-3% генома бактериальной клетки). Используют плазмиды, способные размножаться автономно, давая до 200 копий, а под действием ингибитора биосинтеза протеинов (хлорамфеникола) - до нескольких тысяч. Используют коньюгативные плазмиды (F) и неконьюгативные (R, Col, D). R-плазмиды содержат гены устойчивости к антибиотикам, Col-плазмиды обеспечивают синтез разных колицинов - высокоспецифических антибиотиков, подавляющих жизнедеятельность других штаммов и видов бактерий, Д-плазмиды вызывают биодеградацию. Бактериальная клетка обычно может содержать в своем составе плазмиды только одного типа. Встраивание чужеродной ДНК в векторную плазмиду - довольно редкое событие. Только одна из 10-30 полученных после легирования молекул будет рекомбинантной, т.е. нести в своем составе чужеродный фрагмент. Такие клетки отбирают на селективной среде с антибиотиками. Плазмидные векторы имеют небольшую емкость, в них можно клонировать фрагменты длиной не более 7-8 тысяч нуклеотидных пар (т.н.п.), т.е. они пригодны только для клонирования генов прокариот. В генетической инженерии часто используют плазмиду рВR 322, которая содержит репликатор колициногенной плазмиды Col Е1, ген устойчивости к антибиотикам - ампициллину (Amp') и тетрациклину (Тс').

Плазмидные векторы используются чаще всего для размножения (клонирования) гена. В настоящее время клонирование генов успешно осуществляется при помощи полимеразой цепной реакции (ПЦР) в специальных автоматах. Фрагмент ДНК (ген) помещают в прибор, добавляют праймеры (олигонуклеотиды, комплементарные концам фрагмента ДНК), нуклеотиды, ДНК-полимеразу.

Раствор нагревают до 950С, вызывая денатурацию ДНК. Затем смесь охлаждают до 50-650С, и праймеры прикрепляются к концам каждой свободной нити ДНК. Снова повышают температуру до 720С, и ДНК-полимераза начинает присоединять нуклеотиды к праймерам и строить копии цепочки ДНК. Изменяя температуру, повторяют цикл и копируют ДНК десятки и сотни раз. После 20 циклов счет идет на миллионы. Для прокариот сконструированы векторы на основе фага, в которые можно включать фрагменты чужеродной ДНК до 22 т.н.п. Из генома фага вырезают его собственную ДНК, оставляя концевые фрагменты фага неизменными, так как они необходимы для репликации и упаковки ДНК в головку фага (cos-сайты).

Для клонирования и переноса более крупных фрагментов ДНК (30-45 т.н.п.) были сконструированы искусственные векторы - космиды, содержащие cos-участок генома фага, за счет чего они могут упаковываться в голову фага и специальные последовательности (ori-сайт), позволяющие им реплицироваться по плазмидному типу.

Космидами трансформируют клетки E. coli, где они размножаются как плазмиды, и каждая фаговая частица вызывает образование колонии индивидуального бактериального трансформанта. Клонирование фрагментов ДНК от 100 т.н.п. и более осуществляют в специально сконструированных векторах ВАС и VAC. ВАС-векторы получены на основе F-плазмид бактерий и содержат гены, ответственные за репликацию и копийность этих плазмид в бактериальных клетках. Емкость ВАС-векторов составляет 100-300 т.н.п. VAC-векторы представляют собой искусственную дрожжевую минихромосому, содержат центромеру, теломеру и точку начала репликации. В такой вектор можно встроить фрагмент чужеродной ДНК более 100 т.н.п., и такая минихромосома, введенная в клетки дрожжей, будет реплицироваться и вести себя аналогично другим дрожжевым хромосомам при митозе. Эукариотические вирусы нашли более скромное применение в качестве векторов. Практически используется только онкогенный вирус SV-40 и его производные. Все эти векторы - дефектные вирусы, не способные дать полноценные вирусные частицы в клетке хозяина.

Для переноса генов в клетки растений широко используются Тi-плазмиды почвенных агробактерий (Agrobacteria). Последние могут заражать двудольные растения и вызывать образование опухолей - корончатых галлов. Опухоли состоят из дедифференцированных клеток, интенсивно делящихся и растущих в месте заражения. В бактериальных клетках Ti-плазмиды (англ. «tumor inducing» - индуцирующие опухоли) реплицируются автономно; их кольцевая ДНК длиной около 200 т.н.п. Чаще всего встречаются Ti-плазмиды, кодирующие аминокислоты нопалин или октопин. После заражения фрагмент ДНК Ti-плазмиды выстраивается в ДНК растительной клетки, изменяя ее метаболизм и заставляя синтезировать вещества (опины), необходимые бактерии. Этот фрагмент ДНК Ti-плазмиды назван т-ДНК (трансформирующая ДНК); его длина примерно 23 т.н.п. На концах т-ДНК находятся прямые повторы (25 н.п.), которые (наряду с vir-областью) необходимы для вырезания ее из состава плазмиды и интеграции в геном растений. Природная Ti-плазмида очень велика, и после трансформации растений клетки не будут способны к регенерации. В настоящее время конструируют производные Ti-плазмиды, в которых вставляют регуляторный участок Т-области, а вместо ее структурных генов вшивают структурную часть гена, который надо ввести в растение. Такие гены безвредны для растения. На основе Ti-плазмиды сконструированы промежуточный и бинарный векторы. Перспективным вектором считаются Ri-плазмиды (англ. «root inducinq» - индуцирующий корни) из бактерий (A. rhizodenes), вызывающих усиленное образование корешков при заражении бактерий. В отличие от Ti-плазмид Ri-плазмиды служат естественными безвредными векторами, так как трансформированные с их помощью растительные клетки сохраняют способность к морфогенезу и к регенерации здоровых растений. В качестве векторов растений используются ДНК-содержащие вирусы (их только 1-2% от вирусов, инфицирующих растения). Это содержащий одноцепочечную ДНК вирус золотой мозаики фасоли (ВЗМФ) или вирус полосатой кукурузы, а также вирус с двухцепочечной ДНК - вирус мозаики цветной капусты (ВМЦК), поражающий в основном растения семейства крестоцветных. Фитовирусы отличаются высокой копийностью(106молекул на зараженную клетку), малым размером, сильными промоторами. Однако фитовирусы имеют ряд недостатков: небольшую емкость, патогенность и неспособность встраиваться в хромосомы хозяина. Иногда геном ВМЦК встраивают в Т-область Ti-плазмиды и в ее составе интегрируют в ядерный геном различных растений, при этом из состава фитовируса вырезаются области, обеспечивающие его вирулентность. В генной инженерии широко используются геномные библиотеки и библиотеки к-ДНК. Геномная библиотека представляет собой клонированный в составе векторов полный набор последовательностей ДНК какого-либо организма. Полученные при помощи рестриктаз фрагменты ДНК лигируют с плечами фага и упаковывают в уже готовые головки фаговых частиц. Хранят фаговый банк под хлороформом при -700С. Библиотекой к-ДНК называют совокупность векторных плазмид, каждая из которых несет в своем составе к-ДНК. Молекулы к-ДНК, сшитые с векторными молекулами, трансформируют в бактериальные клетки: каждая бактерия получает только одну рекомбинантную плазмиду. Для поиска нужного гена из клонотеки используют индивидуальную радиоактивно меченную и-РНК или синтетические меченые олигонуклеотиды (не менее 30 н.п.), полностью комплементарные участку искомого гена.