2020-05-12
178
Пороговые концентрации веществ. Подобно тому как амплитуда летальных концентраций ограничена снизу CL0, а сверху CL100 или CL05 и CL95, так и область токсических концентраций имеет свои верхние и нижние границы. Концентрации, ограничивающие зону токсического действия снизу, именуют пороговыми концентрациями и определение их, по мнению Н. В. Лазарева [146], Н. С. Правдина [289], С. И. Черкинского [390] и др., является важнейшей задачей токсикологии. Н. С. Правдин [289] писал, что «токсикологическое значение пороговых концентраций заключается в том, что они являются одним из отправных моментов для установления допустимых концентраций».
Однако токсикологическое содержание пороговой концентрации, т. е. минимальной действующей концентрации токсиканта, менее определенно, чем, скажем, понятие «летальная концентрация». Если летальная концентрация определяется в конечном счете свойствами яда и устойчивостью к нему животного, то пороговая концентрация существенно зависит от метода ее установления. Поскольку разрешающие способности различных методик неодинаковы, выводы авторов о пороговой токсичности испытуемого вещества также различны и подчас трудно сопоставимы. Нередко разные авторы для оценки пороговой концентрации одного и того же вещества используют сдвиги в различных функциональных системах и органах, не сообразуясь при этом с механизмами реализации токсического действия данного вещества. Случается, что даже в одной работе при оценке пороговой концентрации используют разные критерии. Так, X. Денцер [519] в качестве пороговой концентрации различных веществ для рыб приводит то порог повреждения, то критический порог.
Исходя из разрабатываемой нами в ихтиотоксикологии концепции физиологической нормы организма 1163, 177, 176, 161], мы считаем, что «в качестве пороговой концентрации должна быть принята такая концентрация, которая вызывает какие-либо выраженные патологические сдвиги в любой отдельно взятой функциональной системе организма» [163]. Иными словами, любой биохимический или физиологический показатель, характеризующий нормальный ход жизнедеятельности целостного организма, может быть использован для обнаружения порогового эффекта того или иного токсиканта. Чем более совершенны методы контроля интересующего нас показателя и чем выше их разрешающие способности, тем быстрее и надежнее можно выявить токсический эффект пороговой концентрации исследуемого вещества.
ПДК веществ. Конечная цель ихтиотоксикологических экспериментов — установление ПДК веществ, поступающих в рыбохозяйственные водоемы. По существу, это пока единственный эффективный способ предотвращения загрязнения водоемов и снижения их рыбопродуктивности. Определение ПДК возможно только с учетом данных острого, подострого и хронического опытов, позволяющих выявить зону токсического действия и пороговую концентрацию. «Узкая зона токсического действия требует, чтобы допустимая концентрация находилась возможно ниже порога токсического действия, чтобы она возможно дальше отстояла от пороговой концентрации. Наоборот, чем шире зона токсического действия, тем вещество менее опасно в смысле возможности острого отравления, тем ближе к пороговой концентрации может быть и допустимая концентрация» [289]. Пороговая концентрация токсиканта является отправной точкой экспериментального выявления ПДК, поскольку пороговая концентрация — это минимальная действующая концентрация, а предельно допустимая — максимальная недействующая концентрация исследуемого вещества. Следовательно, методы определения пороговой и предельно допустимой концентраций того или иного вещества должны быть идентичны.
В современной ихтиотоксикологии все еще нет общепринятого представления о ПДК токсикантов. Некоторые считают, что это безвредная концентрация, не вызывающая гибели рыб. Другие [328, 332] полагают, что «критерием токсичности того или иного вещества для гидробионтов в конечном счете могут быть только плодовитость и качество потомства». Следовательно, ПДК — это такая концентрация, которая не оказывает влияния на плодовитость и качество потомства. Критический анализ сущности этих представлений дан нами в гл. I. Будучи верным в общебиологическом плане, этот критерий имеет весьма ограниченное значение в практическом отношении, поскольку может быть использован только в опытах на гидробионтах с коротким биологическим циклом.
К рыбе этот критерий практически неприменим не только из-за значительной длительности биологического цикла. Плодовитость и качество половых продуктов рыб — функция многих переменных, определяемая нормальным течением разнообразных физиологических процессов. Ход последних может быть нарушен лишь массированным токсическим воздействием, поскольку организм располагает определенными компенсаторными механизмами, обеспечивающими постоянство внутренней среды. Разумеется, чувствительность различных функциональных систем организма к токсическому воздействию неодинакова при различных ядах, и нарушение деятельности одних наступает позже, чем других.
Так, временное обратимое угнетение, например центральной нервной системы мирных рыб, может оказать влияние на их ориентацию, способность к обнаружению и избеганию ядов или взаимоотношения с хищными видами рыб, что приведет к их гибели. Иными словами, нарушение других жизненно важных физиологических процессов может оказать губительное действие на организм задолго до того периода, когда можно будет судить о плодовитости и качестве потомства.
Эти вполне очевидные положения [163] нашли подтверждение в серии экспериментов, выполненных на модели фенолыюй интоксикации гуппи [363]. Согласно полученным данным нарушение приобретенных (условные реакции) и врожденных (сексуальное поведение) рефлексов наступает задолго до нарушения способности к репродукции, которое в свою очередь предшествует гибели подопытных рыб.
Полученные в последние полтора десятилетия многочисленные экспериментальные данные однозначно подтверждают выдвинутое нами [163] представление о том, что ПДК вещества не должна оказывать токсического эффекта ни на одну из многочисленных функций организма, т. е. не должна вызывать патологических сдвигов в любой отдельно взятой функциональной системе организма, ибо нарушение любой из них может привести к нарушению физиологической нормы организма и его биологического благополучия.
ВРЕМЯ ДЕЙСТВИЯ ЯДА
Фактор времени наряду с концентрацией яда играет решающую роль в определении степени токсичности исследуемого вещества. Время является одним из составных элементов отношения концентрация — время, на котором базируется вся математическая функция, объясняющая токсический процесс. Известно, что при одной и той же концентрации токсиканта выраженность и исход токсического процесса меняются в зависимости от времени действия яда на организм. Следовательно, продолжительность наблюдений может оказать и оказывает решающее влияние на оценку степени токсичности того или иного вещества. При ближайшем рассмотрении обнаруживается, что фактор времени имеет неодинаковое содержание. В случае необходимости определения летальной или пороговой концентрации экспозиция (время контакта рыбы с ядом) продолжается до появления интересующего нас признака (смерть или другая патологическая реакция). Здесь регистрируемый эффект развивается в период экспозиции, и время контакта рыбы с ядом частично или полностью входит во время развития реакции. Однако это происходит не всегда, и нередко регистрируемый эффект развивается не во время экспозиции, а значительно позже. В последнем случае между экспозицией и наступлением токсического эффекта имеется значительный промежуток времени, иногда превышающий продолжительность экспозиции в десятки и сотни раз. Это имеет особое значение при анализе причин неожиданной массовой гибели рыб в районах, удаленных от мест сброса промышленных стоков.
Фактор времени играет большую роль при определении пороговых концентраций ПДК токсического агента. Именно в этом случае первостепенное значение имеет продолжительность опытов, в зависимости от которой результаты исследования токсичности вещества могут быть положительными или отрицательными.
Абсолютное большинство исследователей ограничивали и ограничивают продолжительность своих наблюдений несколькими часами, в лучшем случае — 1-2 сут. [778, 542, 791, 469]. При изучении острого и сверхострого отравления рыб, т. е. отравления высокими концентрациями яда, этого времени опыта обычно вполне достаточно для получения экспериментальной модели той или иной интоксикации и решения вопроса о самом факте токсичности данного компонента промышленных сточных вод и возможности его сброса в водоем без предварительной нейтрализации или снижения концентрации. Значение таких опытов вполне определенно, тем более что, по мнению П. Вивье [830], следует строго различать кратковременные (1-2 ч) и более длительные (несколько часов, суток, недель и т. д.) загрязнения. В первом случае, как и в лабораторных исследованиях, имеет место кратковременный контакт рыб с ядом.
Другое дело, когда речь идет об изучении вещества малой токсичности или выявлении токсического эффекта малых концентраций яда. В этом случае продолжительность наблюдений приобретает первостепенное значение. Практические рекомендации по биологическому нормированию ПДК токсического вещества в этом случае могут быть даны лишь с учётом данных хронического эксперимента.
В ранних опытах Н. С. Строганова и А. Т. Пажиткова [337] показано, что при использовании в качестве критерия токсичности меди гибель испытуемых рыб, время контакта их с ядом играет ведущую роль в определении его летальной концентрации. Так, увеличение продолжительности наблюдения до 2 мес. выявляло летальное действие меди на карасей уже при ее концентрации 1 мг/л. Однако если бы авторы ограничили длительность опытов 8 сут, то пороговая летальная концентрация меди оказалась бы в 6 раз выше (6 мг/л). Аналогичные результаты были получены авторами и в опытах на уклейке с углекислым аммонием. Наблюдения, проводившиеся в течение 24 ч, выявили летальную концентрацию 50 мг/л по азоту (углекислый аммоний). Увеличение времени контакта рыб с ядом до 15 сут приводило к их гибели при концентрации яда, в 2 раза меньшей (24 мг/л).
Универсальность этого правила (зависимость пороговой летальной концентрации яда от времени контакта рыб с ним) подтверждена при испытании токсичности химических соединений других классов, в частности фенолов [37а, 187, 188].
М. Ф. Вернидуб [37а] в опытах на личинках лосося убедительно показала, что в зависимости от продолжительности опыта существенно меняется и пороговая летальная концентрация: концентрация нелетучих фенолов 50 мг/л вызывает гибель рыб за 4 сут, а концентрация 3 мг/л — за 18-20 сут.
В наших опытах, выполненных на сеголетках (140 особей) и взрослых карасях в сходных методических условиях (температура 13-15° С, содержание кислорода в воде 5-6,5 мг/л, рН 7,3-7,6 и жесткость воды 9,2-10,6° Н), также выявлено решающее значение фактора времени в проявлении летального эффекта малых концентраций фенола. За 96 ч наблюдений концентрация фенола 25 мг/л приводила к развитию у рыб лишь ряда симптомов фенольной интоксикации без летального исхода. Увеличение продолжительности опытов до 10 сут само по себе без изменения концентрации яда вызывало 100%-ную гибель испытуемых рыб. Анализ хода кривых, представленных на рис. 7 и 8 (25 и 50 мг/л фенола), показывает, что по мере увеличения времени контакта рыб с ядом нарастает сила летального эффекта, что проявляется в постепенном увеличении процента гибели испытуемых рыб. Естественно, первыми гибнут наименее устойчивые особи, но их смертность, нарастающая по мере увеличения контакта рыб с ядом, соответствует в известной мере нарастанию токсического процесса у более выносливых рыб и может иметь прогностическое значение для выборочной совокупности в целом.
Рис. 7 Динамика гибели карасей в растворе фенола (25 мг/л)
Рис. 8. Динамика гибели карасей в растворе фенола (50 мг/л)
Серия работ, выполненных в последние годы с инсектицидами, показала также, что с увеличением времени испытания изменяются представления о степени токсичности этой группы соединений.
У. Матсуэ, Т. Эндо и К. Табата [693] в экспериментах с паратионом на золотых рыбках установили, что с продлением опытов до 30 сут паратион оказывает токсическое действие в концентрации, в 30 раз более низкой, чем при 48-часовом воздействии летальной концентрации (CL50). На основе полученных данных авторы высказывают сомнение относительно возможности рекомендовать в качестве допустимой для водоемов концентрацию паратиона 0,1 CL50, которую в США часто принимают за безвредную.
Испытание токсичности некоторых гербицидов, в частности 2, 4, 5-трихлорфеноксиуксусной кислоты, 4-хлор-2 метилфенолксиуксусной кислоты и ряда других, показало, что продление экспериментов до 3 нед и более вызывает токсические явления и даже гибель подопытных рыб без существенного изменения концентрации яда [458].
К. Клинглер [641] приводит данные, полученные в опытах снитритом натрия. Хотя это вещество малотоксично, его концентрация 50 мг/л вызывает гибель гольянов в среднем за 14 сут, при индивидуальном разбросе — от 34 ч до 23 сут.
Привлекает внимание обстоятельное исследование Р. Маркеттн [690], выполненных на карасях, обработанных различными концентрациями аммиака. Опыты проводились в жесткой воде при температуре 15-15,5°С, рН 6,8-7,0. Продолжительность наблюдений 110 сут. Большинство подопытных рыб погибли на 30-40-е сутки с начала опыта с характерными изъявлениями, особенно хорошо выраженными на анальном и хвостовом плавниках. Гистологический анализ показал, что это форма типичного некроза. Автор считает, что в данном случае, хотя и не исключено прямое внутреннее действие аммиака на рыб, скорее имеет место действие яда на защитный слой слизи, вырабатываемой железами, вследствие чего возможно более легкое проникновение бактерийных и грибковых возбудителей в организм рыбы.
Данные, полученные в опытах с различными группами химических токсикантов, убедительно свидетельствуют о ведущей роли фактора времени в определении степени токсичности различных групп веществ. Особое значение длительность опытов приобретает при изучении малотоксичных соединений, вредное действие которых проявляется только после длительного контакта рыб с ними.
В качестве показателя токсичности того или иного соединения и уровня устойчивости рыб к нему часто используют время их выживания в токсическом растворе. Кроме того, в ряде работ применяют и другие критерии токсичности: время погружения, необходимое для начала токсического процесса; время развития токсического процесса до некоторого хорошо заметного уровня (время опрокидывания рыб) и минимальное время экспозиции для наступления токсического процесса (летальное время).
Первый из этих критериев — время погружения — весьма близок по своему содержанию к понятию «латентный период», т. е. промежутку времени между началом контакта рыбы с ядом и первыми признаками у них отравления. Первоначальные признаки отравления и длительность латентного периода интоксикации будут различны в зависимости от природы испытуемого вещества и вида рыб. Так, у большинства видов рыб первыми признаками отравления фенолами являются бурная двигательная активность и неориентированное плавание, а у угря и налима — судорожные подергивания мышц туловища. При испытании токсичности растворов тяжелых металлов в качестве первого признака отравления рыб может быть использовано расстройство дыхания. Вполне понятно, что время погружения или латентный период будут весьма различны по абсолютной величине и определяются главным образом механизмами реализации токсического действия яда. Яды, оказывающие преимущественное действие на центральную нервную систему, имеют короткий латентный период, исчисляемый секундами, а те из них, которые оказывают наружное или локальное воздействие на рыб, имеют более длительный латентный период (минуты, часы и даже сутки).
Критерий «время погружения» весьма ценен с точки зрения оценки латентного периода интоксикации, который может быть использован для характеристики степени чувствительности рыб к яду. Именно поэтому он малополезен в качестве показателя степени устойчивости рыб к яду или степени токсичности испытуемого вещества.
Второй критерий представляет собой время наступления одного из наиболее показательных признаков отравления. Чаще всего в качестве такого признака используют потерю рефлекса равновесия, т. е. время опрокидывания, именуемое также временем проявления (manifestation time). По К. Вурману и X. Вокеру [860J, под временем проявления подразумевается время, в течение которого рыба теряет способность к движению и не может долго удерживать равновесие в проточной воде. Широкое использование этого критерия для оценки токсичности вещества встречает ряд общих и частных затруднений. Прежде всего в случае испытания токсичности веществ, не влияющих на нервную систему рыб (большинство солей тяжелых металлов, щелочи, неорганические кислоты), потеря рефлекса равновесия наступает обычно незадолго до их гибели. Кроме того, при действии на рыб других веществ, например цианидов, в качестве наиболее характерного признака отравления кроме потери рефлекса равновесия могут быть использованы иные, скажем, изменение интенсивности потребления кислорода.
Однако даже при воздействии на рыб ядов, вызывающих потерю рефлекса равновесия, едва ли имеет смысл использование времени проявления в качестве критерия токсичности. Опыты показывают, что при изучении токсичности ядов фенольпого ряда для различных видов рыб в растворах концентрацией от 10 до 50 мг/л (в зависимости от вида) имеет место волнообразное течение интоксикации, при котором периоды потери рефлекса равновесия и полного обездвижения чередуются с кратковременными появлениями у рыб способности к импульсивным перемещениям в боковом положении. Эти наблюдения в первую очередь относятся к резистентным видам рыб, например карасю. Но даже в краткосрочных опытах по острому отравлению [192] малоустойчивых видов рыб (форель, окунь) время проявления весьма вариабельно, что не позволяет с достоверностью судить о степени устойчивости рыб или степени токсичности вещества. Критерий «время проявления», ограничивающий длительность наблюдений несколькими часами, не позволяет уловить качественные и количественные особенности протекания токсического процесса у рыб при изменении концентрации ядов.
Имеются и другие серьезные препятствия для использования этого критерия. Во-первых, нет никаких сведений относительно характера связи между временем проявления и временем гибели рыб. Результаты наших опытов, полученные на большом количестве испытуемых рыб, показывают, что при значительном, иногда десятикратном, увеличении или уменьшении концентрации яда в растворе время проявления претерпевает незначительное изменение, редко превышающее двукратное. При этом соотношение между временем проявления и временем гибели испытуемых рыб оказывается различным как при разных концентрациях токсического вещества, так и при разных веществах даже в опытах на одном виде рыб. Во-вторых, при равном времени проявления время гибели рыб весьма заметно колеблется в зависимости от вида. Так, у форели и плотвы, плотвы и карасей при сходном времени проявления время гибели резко отлично и находится в прямой зависимости от устойчивости вида.
Несмотря на ограниченные возможности критерия «время проявления», его можно использовать в качестве показателя острой токсичности в тех случаях, когда необходима оперативная информация для однозначного ответа на вопрос о самом факте токсичности сточных. вод сложного состава, поступающих в рыбохозяйствен-ный водоем с конкретного предприятия. Иными словами, этот показатель может быть использован при биотестировании на рыбах.
Третий критерий — летальное время — определяется на основе измерения времени экспозиции, приводящего к развитию полностью или частично необратимого отравления. Этот критерий токсичности имеет существенное значение в тех случаях, когда перед исследователем стоит необходимость изучения спорадических загрязнений водоема. Вместе с тем токсикологическое содержание критерия «летальное время» не вполне ясно. В цитированной выше статье К. Вурмана и X. Вокера, посвященной изучению токсичности аммония и цианидов, авторы делят период погружения рыбы в токсический раствор до смерти на два этапа: первый этап (латентный) включает период нахождения рыбы в токсическом растворе до того момента, когда она еще способна при перенесении в чистую воду вернуться в нормальное состояние; второй этап (летальный) характеризуется периодом необратимого отравления. Бесспорно, такое деление представляет интерес в плане оценки обратимости токсического процесса, однако оно не позволяет характеризовать качественный состав симптомо-комплекса отравления, фазность его течения и тем более судить о степени резистентности испытуемых рыб. Явно неудачно обозначение первого этапа латентным, так как обратимость токсического процесса возможна при весьма глубоких и явных признаках отравления, которые никак нельзя назвать скрытыми. По-видимому, этот вопрос нуждается в дальнейшей экспериментальной доработке и подборе соответствующей терминологии.
Четвертый критерий — время выживания (survival time) — представляет собой время, необходимое для развития летального отравления. Нам представляется, что время гибели рыб является одним из наиболее полноценных критериев токсичности различных веществ и динамики изменения токсичности в зависимости от концентрации вещества в опытах с острым отравлением.
Столь дифференцированный учет всех этапов развития токсического процесса во времени позволяет не только наиболее полно и точно характеризовать границы токсичности того или иного компонента промышленных сточных вод для рыб, но и точно измерить латентный период, скорость развития и время гибели испытуемых рыб. К сожалению, в современных работах по токсикологии рыб произвольно используются только один или два из рассмотренных критериев токсичности вещества, что весьма затрудняет сопоставление данных, полученных в разных лабораториях.
Успешное решение многих вопросов ихтиотоксиколо-гии, связанных с определением степени токсичности различных компонентов промышленных сточных вод, требует унификации используемых критериев, крайне необходимой с точки зрения сопоставимости литературных сведений и координации научно-исследовательских работ по этой тематике. Определенный интерес в этом плане может представить среднее время гибели. Наш личный опыт и литературные данные показывают, что время гибели рыб при неизменной концентрации яда претерпевает чрезвычайно Широкое индивидуальное колебание, вследствие чего получается широко рассеянный вариационный ряд. Распределение частот в таком ряду хотя и приближается к нормальному, однако нередко существенно отклоняется от него.
Если по оси ординат откладывать процент гибели рыб, а по оси абсцисс — промежуток времени, в течение которого наступает летальный эффект, то получим кривую зависимости между временем и процентом погибших животных, называемую кривой время — действие (time — action). Довольно часто она имеет типичную S-образную форму (как и кривая концентрация — действие), подобную той, которую мы получили в опытах с фенолом на карасях (рис. 9). Однако нередко форма этих кривых существенно отличается от S-образной (рис. 10).
Рис. 9. Динамика гибели карасей в растворе фенола (100 мг/л)
Рис. 10. Динамика гибели карасей в растворе фенола (200 мг/л)
В предыдущей главе были изложены способы выпрямления S-образной кривой, один из которых основан на том, что по оси абсцисс вместо времени откладывают его логарифмы, а по оси ординат вместо процента погибших животных — соответствующие пробиты. Иногда зависимость время — действие имеет форму прямой, о чем свидетельствуют результаты наших опытов [188] на сеголетках карася. Графическое изображение полученных данных представлено на рис. 11.
Рис. 11. Динамика гибели сеголетков карася в растворе фенола (50 мг/л)
Имеется несколько методов [454, 668], которые могут быть применены для исследования выпрямленных прямых и определения среднего летального времени LT50, а также стандартной ошибки этого показателя. Обычно на графике находят точки, соответствующие LT16, LT50 и LT84 (т. е. время гибели 16, 50 и 84% испытуемых животных). Стандартную ошибку в этом случае определяют либо по графику (функция наклона прямой), либо по формуле
