Идентификация микроорганизмов по генетической структуре

  Элементарной единицей наследственности является ген, несущей свойственную только ему информацию и представляет собой участок ДНК у бактерий, ДНК или РНК у вирусов. Гены объединены в геном. Бактериальные гены локализованы в хромосоме или в плазмиде, которые способны к самостоятельной репликации, т. е. являются репликонами.  

    Плазмиды  содержат двунитевую ДНК и входят состав хромосомы или располагаются автономно и придает микробам определенные преимущества при существовании в неблагоприятных для вида условиях.    

    В состав бактериального генома входят подвижные генетические элементы, которые не являются самостоятельными репликонами, а представляет собой составную часть ДНК нуклеоида или плазмиды. Они способны перемещаться внутри одного репликона или между репликонами. По сложности их структуры выделяют транспозоны и вставочные последовательности (IS-элементы). 

  Транспозоны - это крупные сегменты ДНК, состоящие из IS-элементов. Помимо IS-элементов в состав транспозонов входят дополнительные структурные гены, обеспечивающие синтез токсинов или устойчивость микроба к антибиотикам и др.  .

     Вставочные последовательности имеют размеры 1000н.п.и содержат только  гены, которые необходимы для их собственного перемещения - транспозиции.  

   Изучение генетики микроорганизмов определило развитие генной инженерии,что лежит в основе биотехнологии, то есть получения продуктов из биологических объектов или с применением биологических объектов (бактерии, дрожжи, вирусы, водоросли).

    В различных лабораториях были созданы штаммы Е. coli, синтезирующие гормон роста человека, инсулина, интерферона и др.            

    В разработке находятся генно – инженерные вакцины против малярии, ВИЧ - инфекции, сифилиса, холеры, гриппа и др.  

    Знание генетики микробов позволило разработать современных молекулярно-генетических методов диагностики (ДНК– зонды, полимеразная цепная реакция).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

В основе ПЦР (метода амплификации ДНК in vitro) лежит способность однонитчатой ДНК (праймера) достраиваться и взаимодействовать по принципу комплементарности с ДНК искомого возбудителя при ее наличии в исследуемом материале.          

Компоненты реакции:

1) исследуемый материал, содержащий молекулу ДНК микроорганизмов (испражнение, мокрота, выделенная чистая культура микроба и др.);

2) праймеры – короткие искусственно синтезированные молекулы ДНК, идентичные соответствующим участкам определяемой ДНК микроба;

3) фермент (ДНК- полимераза), обеспечивающий достраивание второй цепи ДНК;

4) смесь нуклеотидов – строительный материал, из которого синтезируется достраиваемая ферментом цепь ДНК;

Каждый цикл амплификации состоит из 3-х этапов:

1) денатурация ДНК, находящуюся в образце. Для этого нагревают реакционную смесь при t 93-95⁰ С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных;

2) отжиг – присоединение праймеров и ДНК микроба, что происходит в соответствии с правилами комплементарности при t 50-65°C.

3) элонгация – синтез второй цепи ДНК при участии полимеразы при t 72°C (рис.22).

В дальнейшем этапы денатурации, отжига и элонгации многократно повторяются. На каждом цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК определяемого микроба удваивается. Благодаря этому происходит многократное удвоение специфических фрагментов ДНК. Продукты синтеза первого цикла амплификации служат матрицей для второго цикла, а продукты синтеза второго цикла - матрицей для третьего цикла амплификации. Цикл амплификации проводится в термо-циклере (амплификаторе).         

Достоиннства ПЦР: высокая чувствительность и специфичность, быстрота (применяется для экспресс-диагностики), возможность идентификации труднокультивируемых микроорганизмов (внутриклеточных паразитов и персистирующих микроорганизмов), возможность определения микроорганизмов непосредственно в клиническом материале без предварительного выделения чистой культуры.

Метод рекомбинации

Метод рекомбинации заключается в следующем: а) выделение ДНК из разных клеток и организмов; б) получение гибридных (рекомбинантных) молекул ДНК; в) введение рекомбинантных молекул ДНК в живые клетки; г) создание условий для экспрессии секреции продуктов, кодируемых генами.

Целевые гены, кодирующие те или иные структуры, выделяются из плазмид или хромосом с помощью ферментов – рестриктаз, способных резать ДНК по определенным связам или синтезируются химически. Полученный целевой ген с помощью лигаз сшивают с геном вектора (плазмиды, бактериофаги, вирусы, космиды – гибрид плазмиды с фагом). Рекомбинантная ДНК (плазмида, фаг, вирусная ДНК, космида) встраивается в микробы (E. сoli, дрожжи, вирусы и др.) или животную клетку, которая приобретает новое свойство – способность продуцировать нужные вещества (НВs-АГ вируса гепатита В, антигенов ВИЧ (р24,gp41, gp120 и др.), альфа-интерферона и др.

         Контрольные вопросы:

1.Дайте определение понятиям: генотип и фенотип микроорганизмов.

2.Что представляют собой генетические детерминанты бактерий и вирусов?

3.Чем отличается бактериальная хромосома от хромосом животных и растительных клеток?

4.Что такое плазмиды бактерий? Их локализация, химический состав и функциональная роль.

5.Подвижные генетические элементы.

6.Цели и задачи генной инженерии.

7.Этапы получения рекомбинантных молекул.

8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Назначение, принцип метода.