Для выделения и культивирования облигатных паразитов (вирусов, риккетсий и хламидий) применяются вирусологические методы: заражение тканевых культур, куриного эмбриона и восприимчивых лабораторных животных. Вирусологическое исследование проводится в два этапа: выделение вируса и идентификация вируса. Материалами для вирусологического исследования могут быть отделяемое носоглотки, испражнения, кровь и другие материалы в зависимости от локализации вируса. Вирусологические методы также применяются для культивирования некоторых факультативных паразитов, например, микоплазмы, бруцелл, франциселл, легионелл и др.
Заражение куриного эмбриона в аллантоисную полость с целью
выделения чистой культуры вируса гриппа и идентификации.
1-й этап. Выделение вируса (культивирование вируса).
Для заражения используют куриные эмбрионы 8-14 дневного возраста.
Ход работы:
1)перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона в овоскопе и отмечают карандашом на скорлупе границы воздушной камеры;
|
|
2) яйцо помещают на подставку в вертикальном положении так, чтобы воздушный мешок находился наверху;
3)стерилизация скорлупы на тупом конце яйца в такой последовательности: спиртом, 2 % йодной настойкой ещё раз спиртом и обжиганием;
4) над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы;
5)Пастеровской пипеткой вводят 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала на глубину 2-3 мм ниже границы воздушной камеры;
6) отверстие в скорлупе заклеивают лейкопластырем;
7) инкубация эмбриоа в термостате в течение 2-3 суток при 370 С.
2-й этап. Идентификация выделенной чистой культуры вируса.
Ход работы:
1)яйцо устанавливают на подставке так, чтобы воздушное пространство было наверху;
2)обработка скорлупы последовательно спиртом, йодом, опять спиртом и обжиганием;
3)осторожно снимают лейкопластырь, рассекают и сбрасывают скорлупу, определяют гибель эмбриона, отсасывают аллантоисную жидкость и разливают в пробирки;
4)идентификация вируса проводится по гемагглютинирующей активности (по способности склеивать куриных эритроцитов) в реакции гемагглютинации.
Реакция гемагглютинации (РГА)
Применяется для идентификация вирусов по гемагглютинирующей активности. Вирусы, обладающие гемагглютинирующими свойствами (имеющие гемагглютинин – гликопротеид суперкапсида), способны гемагглютинировать эритроцитов различных животных. Например, вирусы гриппа – куриных эритроцитов.
Компоненты реакции:
1)исследуемый материал – аллантоисная жидкость(гемагглютинин вируса гриппа?);
2)5% суспензия куриных эритроцитов;
|
|
3)физиологический раствор.
Существует два способа постановки реакции: капельный способ на стекле и объемный способ в пробирке.
Капельный способ на стекле:
Опыт:1 капля аллантоисной жидкости + 1 капля 5% суспензии куриных эритроцитов.
Контроль: 1 капля физ. раствора + 1 капля 5% суспензии куриных эритроцитов. Хорошо перемешать сначала контрольную каплю, затем- опытную.
Наличие гемагглютинации (выпадение хлопьев красного цвет) в опыте при ее отсутствии в контроле (гомогенное покраснение) указывает на содержание вируса гриппа в исследуемом материале. Гемагглютинация – это склеивание эритроцитов под влиянием гемагглютинина вируса. Вид вируса гриппа (А,В,С) дифференцируют по антигенной структуре с помощью РСК, ИФА, а серотип – РТГА (практические навыки 9.7). Окончательную идентификацию также можно провести по генетической структуре (ПЦР).