Наличие фага в исследуемом материале – фильтрате исходного материала (воды, суспензии фекалий и т.п.) определяют качественными и количественными методами.
Качественные методы. Присутствие фага в фильтрате определяют по его лизирующему действию на соответствующую бактериальную культуру.
1. Индикация фага в жидкой питательной среде. В пробирку с суточной бульонной культурой чувствительных к фагу бактерий (тест-культурой) вносят исследуемый фильтрат. Инкубируют в термостате 18-20 час при 37оС. Задержка роста бактерий, то есть прозрачный бульон, является показателем наличия соответствующего фага в фильтрате.
2. Индикация фага на твердой питательной среде по Отту.
Тест-культуру, например, дизентерийную культуру, засевают на поверхность МПА в чашке Петри и сверху дорожкой наносят исследумый фаг (фильтрат). Инкубируют в термостате 18-20 час при 37оС. При соответствии фага с данной культурой отмечается задержка роста бактерий по ходу дорожки (рис.20).
Количественные методы - титрование бактериофагов.
|
|
1. Титрование бактериофагов на плотной питательной среде по Грациа.
Для титрования необходимы следующие компоненты:
1)пробирки с различными разведениями бактериофага с полужидким агаром (десятикратные разведения исследуемой суспензии фага - 10-2-10-7 в зависимости от предполагаемого титра);
2) ряд чашек Петри с МПА;
3)суточная бульонная культура чувствительная к фагу бактерий (E. сoli, S.aureus или др.тест-культуры).
Смешивают разведения фага с суточной бульонной культурой и выливают на поверхность МПА в чашку Петри, где она застывает в виде тонкой плёнки, в которой неподвижно фиксированы бактерии. Чашки инкубируют при 370 С в течение 18-24часов. При этом незаражённые бактерии, размножаясь, образуют сплошной газон роста на поверхности агара. Каждая инфицированная фагом бактерия лизируется. В результате на сплошном бактериальном газоне появляются четко очерченные зоны лизиса – негативные колонии. Число негативных колоний равно количеству жизнеспособных фаговых частиц в засеянной смеси. Титр фага определяют по последней чашке, где появляются негативные колонии, то есть титром фага называется то максимальное разведение, при котором появляются негативные колонии.
2. Титрование бактериофага в жидких средах по Аппельману.
В 9 пробирках приготавливают десятикратные разведения исследуемой суспензии фага с МПБ. В качестве контроля берут МПБ без бактериофага. Во все пробирки добавляется по 0,25 мл культуры бактерий, например, E.сoli. Засеянные пробирки помещаются в термостат на 24 часа при 370 С, после чего отмечаются результаты опыта. Титром бактериофага называется то наибольшее его разведение, при котором наблюдается полный лизис бактерий (бульон остается прозрачным).
|
|
Реакция фаголизиса
Реакция фаголизиса применяется для идентификации выделенной чистой культуры бактерий по фагочувствительности. Реакцию ставят в двух пробирках: №1 (опыт) и №2 (контроль). Реакция фаголизиса изучаем на примере идентификации выделенной чистой культуры S.sonnei из испражнения при подозрении на дизентерию.
Компоненты | Опыт | Контроль |
1. МПБ 2.Исследуемая дизентерийная культура (S.sonnei) 3. Монофаг S. sonnei | + + + | + + - |
Посевы инкубируют в термостате 18-24 часов при 370 С.
При наблюдении за посевами впервые часы бульон в пробирках слегка мутнеет вследствие размножения бактерий. В дальнейшем в контрольной пробирке (без бактериофага) помутнение усиливается; в пробирке с бактериофагом через 6 часов происходит просветление в результате лизиса бактерий. Учет реакции проводятся по просветлению МПБ в результате лизируещего действия монофага на бактерии.
Реакция фаготипирования S.aureus
Определение фаготипа проводится с помощью специальных наборов типовых фагов и является одним из методов внутривидовой дифференциации бактерий. Реакция фаготипирования применяется с целью установления источников и путей передачи инфекции при госпитальных, кишечных заболеваниях и пищевых отравлениях.
Испытуемую суточную бульонную культуру S.aureus равномерно распределяют на поверхности подсушенного агара в чашке Петри. Дно чашки расчерчивают на 22 квадрата по числу фагов, затем капают фаги по одному в каждый квадрат. Посев инкубируют в термостате 18-24 часа при температуре 37°С.
На 2-й день проводят учёт результатов; фаготип культуры соответствует тому фагу, который вызывает её полный лизис (рис.21). Также проводится фаготипирование брюшнотифозных (44 типа) и паратифозных бактерий (15 типов), энтеропатогенных эшерихий (24 типа).
Контрольные вопросы:
1.Методы культивирования бактерий.
2. Методы культивирования риккетсий, хламидий и микоплазмы.
3. Методы выделения чистых культур аэробных и факультативно-анаэробных бактерий.
4.Метод Дригальского.
5.Методы создания анаэробных условий.
6.Этапы выделения чистой культуры анаэробных бактерий.
7. Короткий «пестрый» ряд.
8.Методы изучения протеалитической активности бактерий.
9.Принципы определения каталазной и плазмокоагулазной активности стафилококков.
10.Вирусологические методы.
11.Механизм и применение реакция гемагглютинации (РГА).
12.Методы индикации бактериофагов.
13.Механизм и применение реакции фаголизиса.
14. Реакция фаготипирования S.aureus. применение, принцип метода.