Методы оценки состояния плода

В настоящее время зародыши человека доступны для лабораторных иссле- дований практически на любой стадии внутриутробного развития. Однако ме- тоды, применяемые для этих целей, различны. На самых ранних стадиях, т.е. еще до имплантации, обследование эмбрионов, равно как и диагностика генных и хромосомных болезней, возможны только с помощью методов и подходов, при- меняемых в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) в центрах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Подавляющее большин- ство мероприятий ПД во всем мире и в России осуществляется после 10-й не- дели, преимущественно в 1 и отчасти во II (15-21-я недели) триместре беремен- ности. Именно на этот период приходятся все основные операции по получению плодного материала. В III триместре инвазивная ПД проводится достаточно редко и только в связи с необходимостью решения вопроса о тактике ведения беременности и родов в зависимости от диагноза заболевания у плода.

Методы ПД могут быть прямыми, когда исследуется сам плод, либо непря- мыми, когда объектом исследования является беременная женщина. В свою оче- редь, прямые методы подразделяются на неинвазивные и инвазивные.

Непрямые (обследование беременной):

1. Клиническое (акушерско-гинекологическое).

2. Медико-генетическое:

- генеалогическое;

- цитогенетическое;

- молекулярно-биологическое.

3. Анализ эмбрионспецифических белков:

- α-фетопротеин;

- хорионический гонадотропин;

- эстриол;

- другие.

Прямые (обследование плода): 1. Неинвазивные:

- ультразвуковое исследование. 2. Инвазивные:

- получение плодного материала:

- хорионбиопсия (I триместр);

- плацентобиопсия (II триместр);

- амниоцентез: ранний (13-14н. б.); обычный (15-22 н. б.);

- кордоцентез (II – III триместр);

- фетоскопия (II – III триместр).

- лабораторные:

- цитогенетические;

- молекулярно-генетические; - биохимические;

- иммуноцитохимические.

Непрямые методы

Цель применения непрямых методов – отбор беременных групп высокого риска рождения детей с врожденной и наследственной патологией, требующих углубленного дополнительного обследования. Непрямые методы позволяют су- дить о состоянии плода по биохимическим показателям в крови беременной, по результатам акушерско-гинекологического анамнеза и медико-генетического консультирования.

Биохимические исследования маркерных сывороточных белков крови бе- ременной, равно как ультразвуковое сканирование, в настоящее время рассмат- ривают как обязательные скринирующие методы дородовой диагностики, направленные на выявление женщин с высоким риском рождения детей с хро- мосомными болезнями и пороками развития.

Биохимический скрининг (БС) беременных является общепринятым мето- дом отбора группы женщин с высоким риском ВПР плода. Суть метода заклю- чается в исследовании отклонений сывороточных маркеров (СМ) от нормы при хромосомной патологии плода. В разных странах проведено большое количество исследований для отбора оптимальных маркеров и оптимальных сроков их опре- деления в крови беременных. В настоящее время принято использовать для скри- нинга два интервала: в 1 триместре – 9-13 нед. беременности – отбирается группа пациенток высокого риска рождения детей с хромосомными аномалиями (ХА), во II триместре – 15-18 нед. – с ХА и некоторыми пороками развития (дефекты заращения нервной трубки открытого типа).

Биохимический скрининг во II триместре начал проводиться в 80-90-х гг. прошлого века и показал хорошую эффективность: от 65 до 74% пациенток с

трисомией 21 у плода попадает в группу высокого риска ХА. В 1 триместре бе- ременности показана более высокая эффективность выявления трисомии 21 (от 82 до 94 %), но не следует забывать, что часть беременностей при синдроме Да- уна (СД) у плода прерывается на ранних сроках. При положительном результате биохимического скрининга беременной рекомендуется консультация генетика с целью направления на инвазивную пренатальную диагностику. Диагностика подразумевает получение и лабораторный анализ плодного материала (ворсин хориона/плаценты, клеток плода из амниотической жидкости или лимфоцитов пуповинной крови) для исключения наиболее распространенных трисомий в клетках плода или полного анализа его кариотипа.

К маркерным белкам в крови матери относятся а-фетопротеин (АФП), хо- рионический гонадотропин (ХГЧ) и его свободная β-субъединица (свободный β- ХГЧ), свободный (неконъюгированный) эстриол (НЭ), плазменный ассоцииро- ванный с беременностью белок А (ПАББ-А, англ. РАРР-А), ингибин А (ингА) и некоторые другие.

Все эти белки являются эмбрионспецифичными, т.е. продуцируются клет- ками самого плода или плаценты и поступают в кровоток матери. Их концентра- ция в сыворотке крови меняется в зависимости от срока беременности и от со- стояния плода.

Важный этап в организации скрининга заключается в выборе критерия, по которому его результаты будут считаться положительными (пациентки нужда- ются в дополнительном обследовании) или отрицательными (пациентки не от- бираются в группу повышенного риска патологии плода).

В конце 70-х гг. XX в. появился биохимический скрининг беременных на содержание АФП в сыворотке крови для выявления женщин группы высокого риска по наличию открытых дефектов заращения нервной трубки у плода. Од- нако, повышенное содержание АФП обнаружено у беременных не только с ВПР, но и с многоплодной беременностью, при внутриутробной гибели плода и т.д. Сниженный уровень АФП является маркером повышенного риска рождения ре- бенка с СД. При дальнейшем исследовании оказалось, что определение содержа- ния одного маркера малоинформативно – только около 30 % плодов с СД войдет в группу высокого риска. После значительных исследований по поиску других эмбриональных белков – маркеров сыворотки крови беременной и ассоциации их отклонений с наиболее частыми патологическими состояниями плода список расширился: стали определять уровень хорионического гонадотропина (ХГ) или его свободной β-субъединицы (свободный β-ХГ), свободного (неконъюгирован- ного) эстриола (НЭ) и ингибина А (ингА). В сыворотке крови беременной часто определяют уровень альфа-фетопротеина (АФП), хорионического гонадотро- пина и неконъюгированногоэстриола (НЭ) («тройной тест»).

Следует иметь в виду, что самой распространенной причиной положитель- ных результатов скрининга является неверное определение срока беременности, поэтому при несоответствии уровня белка норме необходимо, в первую очередь, уточнить срок беременности с помощью УЗИ.

В 1 триместре беременности наибольшие отклонения при ХА у плода наблюдаются в содержании плазменного ассоциированного с беременностью белка А (ПАББ-А) и свободного β-ХГЧ в крови матери. ПАББ-А является проте- азой, расщепляющей белки, связывающие инсулиноподобный фактор роста 1 (ИПФР1). Низкий уровень ПАББ-А – сильный маркер, который увеличивает риск рождения ребенка с СД. Уровень маркеров определяют в 9-13 нед. беремен- ности. Концентрация маркеров сильнее зависит от срока беременности, чем во II триместре, поэтому окончательный расчет риска можно проводить только после точного установления размеров плода при УЗИ.

Прямые неинвазивные методы

Основным и наиболее эффективным прямым неинвазивным методом явля- ется исследование плода с помощью ультразвукового аппарата. Совершенство- вание ультразвуковой техники, повышение ее разрешающей способности позво- ляет уже в конце I триместра заподозрить хромосомную патологию у 80 % пло- дов с аномальным кариотипом, а во II триместре – до 80-98 % плодов с анатоми- ческими пороками. УЗИ, безусловно, является наиболее эффективным современ- ным неинвазивным методом ПД. Следует напомнить, что многие видимые от- клонения в развитии плода (УЗ-маркеры), в том числе и ВПР, позволяют только заподозрить у плода наличие хромосомных или, реже, генных болезней. Такая диагностика возможна только путем специальных лабораторных исследований плодного материала. Для его получения разработаны и широко используются в ПД различные инвазивные методы. Выбор инвазивного метода определяется сроком беременности, показаниями к его проведению, инструментальной и ме- тодической оснащенностью центра ПД, а также квалификацией медицинского персонала.

При первом скрининговом УЗИ (10-14 нед беременности) основной целью является выявление увеличения толщины воротникового пространства (ТВП), как основного эхографического маркера хромосомных аномалий. Кроме того, важными задачами УЗИ при данных сроках являются оценка жизнеспособности плода, числа плодов в матке, уточнение срока беременности (это особенно важно для последующей интерпретации результатов БС), исключение грубых, абсо- лютно летальных форм ВПР, визуализация носовых костей и т. д.

При сроке 18-21нед беременности основное внимание обращается на ана- томические особенности строения плода, его размеры, соответствие сроку бере- менности. В эти сроки выявляется большинство распространеннных форм ВПР, аномалии плаценты и пуповины.

Третье скрининговое УЗИ (32-34нед беременности) направлено на изуче- ние темпов роста плода, его анатомических и функциональных особенностей, выявление ВПР с поздней манифестацией, проведение анализа состояния систем фетального жизнеобеспечения (сердце, плацента, пуповина, оболочки) для выра- ботки оптимальной тактики и стратегии родов.

Прямые инвазивные методы

Основная доля инвазивной ПД с целью исключения хромосомных болез- ней проводится в группах риска, сформированных по результатам ультразвуко- вого и биохимического скрининга. Под инвазивными методами ПД следует по- нимать внутриматочные вмешательства при ультразвуковом контроле в усло- виях операционной с целью получения плодного материала для последующего гистологического, биохимического, цитогенетического или молекулярно-гене- тического анализа (табл.1).

Зародыш человека доступен для исследований, а значит и для диагностики, практически на любой стадии развития. Очевидно, арсенал методов и их диагно- стические возможности могут быть различными. Выбор инвазивного метода определяется сроком беременности, показаниями к его проведению, инструмен- тальной и методической оснащенностью центра ПД, а также квалификацией ме- дицинского персонала. Группы риска

Согласно классическим представлениям группы риска женщин по наслед- ственной и врожденной патологии у плода следующие: женщины в возрасте старше 35 лет; женщины, имеющие не менее двух самопроизвольных абортов на ранних сроках беременности; имеющие в семье ребенка или плод от предыдущей беременности с болезнью Дауна, с другими хромосомными болезнями, с множе- ственными врожденными пороками, с семейным носительством хромосомных перестроек; с моногенными заболеваниями, ранее диагностированными в семье или у ближайших родственников; применявшие перед и на ранних сроках бере- менности ряд фармакологических препаратов (цитостатики и другие препараты); с перенесенными вирусными инфекциями (гепатит, краснуха, токсоплазмоз и др.); из семьи, где было облучение кого-нибудь из супругов до зачатия.

В настоящее время группы риска для инвазивной ПД формируются глав- ным образом по результатам программ ультразвукового и биохимического скри- нинга, а также на основании медико-генетического консультирования. Однако существуют так называемые абсолютные показания к пренатальной диагно- стике, когда врач должен направлять беременную на консультацию к генетику сразу после постановки на учет. Эти показания включают:

- наличие у супружеской пары ребенка или плода с болезнью Дауна или другими хромосомными болезнями;

- наличие у супружеской пары ребенка или плода с множественными врожденными пороками развития;

- семейное носительство хромосомных перестроек;

- наличие в семье моногенных заболеваний: муковисцидоза, фенилкето- нурии, гемофилии А и В, миопатии Дюшенна, миотонической дистрофии, адре- ногенитального синдрома, спинальной амиотрофии Верднига-Гоффмана, хореи Гентингтона и др.;

- ультразвуковые маркеры хромосомных болезней у плода;

- высокий риск болезни Дауна по результатам комбинированного (УЗ и БС) скрининга в I триместре, биохимического скрининга МСБ или наличия УЗ- маркеров во II триместре беременности. Важно помнить, что спектр показаний и объем инвазивной ПД для каждого центра ПД определяется его диагностиче- скими возможностями.

Принципы цитогенетического анализа в пренатальной диагностике

Для препаратов из культур клеток достаточным считается наличие 20-50 метафазных пластинок на предметное стекло. Качество «прямых» препаратов из цитотрофобласта хориона или плаценты удовлетворительно при наличии на стекле более 10 метафаз, пригодных для подсчета и анализа структуры хромо- сом.

Для стандартного кариотипирования достаточно качества дифференциаль- ной окраски 400-550 сегментов на гаплоидный набор. Для анализа микропере- строек хромосом требуется разрешение более 800 сегментов, которое достига- ется при использовании репликационных вариантов дифференциального окра- шивания.

Оптимальным для кариотипирования по клеткам ворсин хориона является срок 3-7 дней, клеток амниотической жидкости – 10-16 дней, лимфоцитов пупо- винной крови – 4-7 дней. Увеличение времени анализа обусловлено либо техни- ческими, либо диагностическими проблемами.

Число проанализированных пластинок определяется целью исследования, однако минимальное их число должно быть не менее 5. При стандартном карио- типировании заключение базируется на идентификации и анализе структуры всех хромосом на 2-3 метафазных пластинках, а общее число пластинок для под- счета числа хромосом должно составлять 15-20.При стандартном кариотипиро- вании исключается носительство всех геномных мутаций (анеуплоидий и полип- лоидий) и робертсоновских транслокаций, а также многих реципрокных транс- локаций и некоторых инверсий, особенно если они изменяют морфологию хро- мосом, вовлеченных в перестройку.

Диагностические проблемы кариотипирования плода

Трудности при ПД могут представлять как геномные, так и хромосомные мутации, некорректная интерпретация которых может привести к диагностиче-

34

 

ским ошибкам. Выявленные изменения кариотипа имеют различную диагности- ческую и прогностическую значимость, многие из них требуют проведения до- полнительных уточняющих диагностических мероприятий.

Контаминация материнскими клетками

Образцы эмбрионального материала могут быть контаминированы клет- ками материнского происхождения. При длительном культивировании образцов КАЖ и хориона/плаценты материнские клетки могут пролиферировать и приво- дить к диагностическим ошибкам. Риск ошибок, обусловленных контаминацией, составляет 0,16% при культивировании КАЖ и выше (до 0,4 %) при культивиро- вании клеток ворсин хориона. Избежать контаминации возможно лишь при со- кращении времени культивирования или использовании «прямого» метода при- готовления препаратов. Для контроля чистоты образца могут быть применены разнообразные методы анализа клеток крови и гемоглобинов. Наиболее удобной и надежной методикой является проба на устойчивость фетального гемоглобина к щелочной денатурации.

Мозаицизм, ограниченный плацентой

Особое внимание, которое уделяется хромосомному мозаицизму в ПД, свя- зано с тем, что в отличие от полных форм хромосомного дисбаланса многие мо- заичные трисомии оказываются совместимыми с развитием и живорождением. При этом тяжесть клинических проявлений, в том числе и в пренатальном пери- оде, не обнаруживает прямой корреляции с представительностью аномальной клеточной линии в тканях, доступных для исследования.

Несоответствие (дискордантность) хромосомного набора в клетках хори- она и собственно эмбриона является источником диагностических ошибок в 1-2 % ПД. ОПМ возникает в результате аномальной сегрегации хромосом на ранних стадиях эмбрионального развития и их преимущественной локализацией либо в тканях плаценты, либо в тканях плода. При этом генерализованный мозаицизм (т.е. наличие аномальных клеточных линий как в тканях плода, так и в оболоч- ках) подтверждается в 10% случаев ОПМ.

Структурные перестройки хромосом

Если показанием к кариотипированию плода является носительство струк- турной перестройки одним из родителей, то при выборе способа инвазивного вмешательства необходимо учитывать особенности хромосомной аберрации. Разрешающая способность цитогенетического анализа на «прямых» препаратах

35

 

хориона достаточна для точной идентификации перестроек, существенно изме- няющих морфологию хромосом. Наибольшие трудности во всех случаях пред- ставляют небольшие по размеру перестройки, особенно если они локализованы в теломерных сегментах хромосом. Практически во всех случаях семейного но- сительства перестроек целесообразно проводить сравнительный анализ хромо- сом плода и родителей, используя комплекс методов дифференциального окра- шивания и FISН.

Хромосомные аберрации, не унаследованные от кого-либо из родителей, пренатально встречаются относительно редко (0,06—0,20 % всех исследований). При обнаружении хромосомной перестройки, возникшей dе поvо, невозможно полностью исключить несбалансированность хромосомного набора и, тем более, определить наличие генных мутаций в точках разрывов. В этой ситуации риск рождения ребенка с какими-либо аномалиями развития оценивается в 10%.

Молекулярно-цитогенетические и молекулярные методы пренатальной диагностики хромосомных болезней

В настоящее время в ПД хромосомных болезней широко применяются ме- тоды флюоресцентной гибридизации insitu (FISН) с различными вариантами ДНК-зондов, а также молекулярные методы, позволяющие выявлять структур- ные перестройки (аггау СGН) и оценить количество специфичных для каждой хромосомы маркерных последовательностей ДНК.

Метод FISН

Согласно рекомендациям Европейского общества цитогенетиков [http://www.eurogentest.org/fileadmin/templates/eugt/pdf/E.C.A._General_Guideline s] FISН на метафазных хромосомах и интерфазных ядрах с использованием ДНК- зондов является весьма информативным методом в самых разных клинических ситуациях:

• при подозрениях на микроделеционный синдром или повышенный риск микроделеционного синдрома по анамнестическим данным;

• при клинических признаках, позволяющих предположить мозаичную форму определенного хромосомного синдрома;

• при подозрении на хромосомную аномалию, возникшую при стандарт- ном цитогенетическом исследовании.

36

 

В зависимости от задач исследования могут использоваться ДНК-зонды на хромосомные участки (центромеры, теломеры, локусы, сегменты), плечи и це- лые хромосомы.

FISН на метафазных хромосомах показана для идентификации маркерных хромосом и дополнительного материала неизвестного происхождения на абер- рантной хромосоме или при подозрении на делецию хромосомного сегмента; уточнении хромосомных перестроек и точек разрыва, а также при анализе мо- заицизма.

FISН на интерфазных ядрах возможна при анализе численных и структур- ных аномалий кариотипа; определении хромосомного пола и уточнении хромо- сомного мозаицизма.

Метод сравнительной геномной гибридизации

Большие перспективы для ПД открывает метод сравнительной геномной гибридизации – СGН (comparative genomic hybridization), который позволяет ска- нировать весь геном человека с помощью микроматриц, четко улавливать не только хромосомные аберрации, но и тонкие субмикроскопические нарушения, невидимые под микроскопом. Недостатками этого метода на сегодняшний день являются сравнительно высокая стоимость наборов микроматриц и сложности интерпретации полученных результатов в случае выявления у плода микронару- шений, отсутствующих у родителей. Наличие в сети Интернет соответствую- щего информационного банка данных в значительной мере помогает в решении этих проблем. Стремительное развитие метода микроматриц, возможности его автоматизации и широкое внедрение в диагностических центрах Западной Ев- ропы и США вселяют уверенность, что уже в скором будущем этот метод станет общедоступным и в России.

Метод основан на конкурентной полногеномной гибридизации двух образ- цов ДНК, одного – выделенного из ткани с заведомо нормальным кариотипом, а второго – из образца исследуемой ткани. После амплификации и рестрикции по- лученные фрагменты ДНК контрольного и исследуемого образцов метят раз- ными флюорохромами и проводят конкурентную гибридизацию непосред- ственно на цитогенетических препаратах метафазных хромосом (вариант стан- дартной СGН). В более усовершенствованном варианте (аггау СGН) проводится гибридизация исследуемой ДНК на микроматрицах с полногеномным набором фрагментов нормальной ДНК (бактериальные клоны размером около 5000 п.о.,

37

 

так называемые ВАС-клоны) или с иммобилизованными на микроматрицах ко- роткими (20-25 п.о.) синтезированными ДНК-зондами, соответствующими мар- керным SNР-фрагментам ДНК.

При общегеномном исследовании можно выявить числовые и несбаланси- рованные структурные аномалии любой хромосомы, а также определить измене- ния числа копий участка ДНК (СNV), нередко ассоциированных с патологией плода. Выборочный анализ нацелен на выявление анеуплоидий по половым хро- мосомам и аутосомам 21, 13, 18, а также микроделеций, приводящих к наиболее частым синдромам (Прадера-Вилли, Ангельмана, Вольфа-Хиршхорна, «кошачь- его крика», Лангера-Ридеона и др.). Метод СGН не позволяет обнаружить сба- лансированные перестройки хромосом, полиплоидию.

Метод количественной флуоресцентной ПЦР

Данный метод благодаря своей эффективности, специфичности, достовер- ности и возможности автоматизации все шире применяется в ПД наиболее ча- стых хромосомных болезней (трисомии 21, 13, 18,триплоидия, числовые нару- шения гоносом – Х- и У-хромосом), на долю которых по обобщенным данным приходится более 95 % всех хромосомных болезней новорожденных. В России метод КФ-ПЦР появился сравнительно недавно. Метод основан на количествен- ном определении высокополиморфных тандемных повторов (ВТК-маркеров), специфичных для каждой хромосомы. Наличие STR-маркеров позволяет марки- ровать гомологичные хромосомы и проводить анализ анеуплоидии на амниоци- тах и биоптатах различных эмбриональных тканей, обычно на ворсинах хори- она/плаценты.

После получения плодного материала проводится экспресс-выделение ДНК из амниоцитов или ворсин хориона, которое занимает 25 мин, затем прово- дится мультиплексная ПЦР с флюоресцентно-меченными праймерами (3 ч) и ка- пиллярный электрофорез на автоматическом секвенаторе (1 ч). Если в результате проведенного анализа в образце ДНК выявлено нормальное соотношение разме- ров пиков для всех проанализированных STR-маркеров (не менее 2 информатив- ных маркеров для каждой исследуемой хромосомы), то определение считается информативным. В случае выявления трисомии по одной из хромосом прово- дится повторное выделение ДНК из плодного материала и повторный анализ для исключения влияния «человеческого фактора». При подтверждении полученных ранее данных анализ считается завершенным. При неинформативности маркеров

38

 

по одной из хромосом проводится исследование с использованием дополнитель- ных маркеров. В тех случаях, когда при проведении анализа выявлен только один «трисомный» маркер, тогда как по другим маркерам этой же хромосомы откло- нений нет, необходимо провести анализ ДНК родителей для установления про- исхождения субмикроскопической дупликации.

Таким образом, метод количественной флюоресцентной ПЦР является быстрым скрининговым методом определения основных хромосомных анеупло- идий- 13, 18, 21, а также числовых нарушений половых хромосом, позволяющий с высокой эффективностью диагностировать до 95 % всех хромосомных болез- ней. Однако, несмотря на важные преимущества, метод не является универсаль- ным и предназначен для скрининга только частых хромосомных болезней. Его применение в ПД должно рационально сочетаться с использованием других, бо- лее тонких методов хромосомного анализа, прежде всего со стандартными мето- дами кариотипирования, особенно при наличии у плода УЗ-маркеров хромосом- ной патологии.

 

Список использованной литературы:

1.Джайн К.К. «Основы персонализированной медицины»

2. Журавлева Г.А «Генная инженерия»

3. Гинтер Е.К. «Наследственные болезни»

4. Баранов В.С «Пренатальная диагностика наследственных болезней»

5. Лекционный материал