Цитогенетические методы

Изучения строения и функции хромосом привело к выделению самостоятельного раздела области науки – цитогенетики. Развитие науки началось в 50-60 годы. Удалось получить убедительные картины морфологии всех Х – хромосом человека и правильно определить их диплоидное число. При всем разнообразии отдельных этапов были изучены числовые и структурные изменения хромосомного набора (кариотипа), так называемые хромосомные и геномные мутации.

Для идентификации хромосом применяют количественный морфометрический анализ:

1 - проводят измерение длины хромосомы в микрометрах (микроскопия хромосом производится в остановленной фазе митоза посредством колхицина и отброшенными посредством гипотонического раствора, в результате чего хромосомы лежат свободно)

2 - определяют также соотношение длины короткого плеча к длине всей хромосомы (центромерный индекс).

В 1960 году была разработана первая классификация хромосом человека (Денверская).

Ее основу составляют особенности величины хромосом и расположение первичной перетяжки.

По форме и общим размерам все аутосомы человека подразделяются на 7 групп, обозначаемых латинскими буквами: A, B, C, D, E, F, G. Все хромосомы имеют порядковые номера.

o наиболее крупная пара гомологичных хромосом имеет №1,

o следующая - №2 и т.д.

o половые хромосомы - крупная X и мелкая Y – выделяются отдельно.

o В последнее время разрабатываются автоматические системы для измерения и количественного анализа хромосом. Однако идентификация хромосом только по указанным признакам встречает большие затруднения.

В 1968-1970 гг. были опубликованы работы шведского генетика Касперссона. Он применил для изучения хромосом флуоресцентные красители, в частности акрихин-иприт и его производные.

Красители	особенности строения хромосом
флуоресцентные красители, в частности акрихин-иприт	Последующее изучение в люминесцентном микроскопе показало, что хромосомы не дают равномерного свечения по длине. В ней выявляется несколько светящихся полос, совпадающих с локализацией структурного гетерохроматина. После удаления их хромосом ДНК они теряют почти полностью способность к флюоресценции.
Краситель Гимзы	Если после денатурации ДНК, вызванной нагреванием и некоторыми другими факторами, провести затем ее ренатурацию – восстановление исходной двунитчатой структуры, а затем окрасить хромосомы красителем Гимзы, то в них выявляется четкая дифференцировка на темноокрашенные и светлые полосы – диски. Последовательность расположения этих дисков, их рисунок – строго специфичен для каждой хромосомы. В результате различных вариантов метода удается выявить центромерный и околоцентромерный гетерохроматин (С-диски), диски расположенные по длине хромосом (соответственно Гимзы-диски, G-диски).
перспективный метод изучения хромосом	Захаровым был разработан перспективныйметод изучения хромосом. В основу его положен процесс неодновременной репликации хромосом: одни участки реплицируются раньше, у других этот процесс задерживается, и репликация происходит значительно позднее. Одновременно идет процесс спирализации хромосом, вступающих в митоз. Однако, к тому моменту, когда хромосомы вступают в метафазу, успевает завершиться процесс выравнивания этих различий, и степень конденсации метафазных хромосом становится одинаковой. Было показано, сто можно задержать этот процесс путем введения 5-бромдезоксиуридина (5-БДУ), который является аналогом тимидина – предшественника ДНК. Если 5-БДУ вводить в конце S-периода, то он включается в синтез ДНК, то есть участки хромосом, где находится это вещество, остаются слабоокрашенными, так как была задержана спирализация. Рано редуплицировавшиеся участки хромосомы, успевшие спирализоваться, интенсивно окрашиваются (Р-диски). Расположение темных и светлых дисков при этом методе противоположно тому, что наблюдается при G-окраске.

Сравнительный анализ различных методов окраски показал, что один и тот же диск может выделяться как светлый неокрашенный или темноокрашенный, но порядок расположения дисков идентичен при и всех методиках.

Таким образом, расположение и последовательность имеют закономерный характер. специфичный для каждой хромосомы.

Метод исследования полового хроматина в соматических клетках.
Половой хроматин – это небольшое дисковидное тельце, интенсивно окрашивающееся гематоксилином и другими основными красителями. Они обнаруживаются в интерфазных клеточных ядрах самок млекопитающих и женщин у человека. Непосредственно под ядерной мембраной. Определение полового хроматина нашло применение в судебной медицине.