Метод двойного расщепления и избирательного мечения

На сегодня самым точным методом генотипирования является метод ДРИМ (двойное расщепление и избирательное мечение), который впервые был разработан для клинических изолятов патогенных микроорганизмов Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и Salmonella spp. [8,18].

Метод основан на одновременном расщеплении геномной ДНК микроорганизма двумя рестрикционными эндонуклеазами и избирательном мечении отдельных фрагментов ДНК. Одна из рестриктаз при расщеплении ДНК образует ограниченное число фрагментов с так называемыми 3'-усеченными «липкими концами». Присутствие в реакционной смеси фермента Taq-полимераза и метки биотинилированный дезоксицитозинтрифосфат (Bio-14-dCTP, Invitrogen™) обеспечивает эффективное мечение фрагментов ДНК, имеющих хотя бы один 3'- усеченный конец в реакции достройки (fill-in reaction). В то же время, многочисленные фрагменты ДНК, образованные второй рестриктазой, дают только тупые концы, которые не включают метку. Такая избирательность мечения позволяет уменьшить число фрагментов ДНК с нескольких тысяч до десятков, и выявить это ограниченное число фрагментов на фильтре после их разделения по размеру в обычном агарозном геле [19].

Преимуществом предлагаемого метода является его быстрота (8 часов в сравнении с 3 сутками в методе пульс-гель электрофорез), высокая разрешающая способность, рассчитываемая по индексу дискриминации  [11].

ПГЭ-метод

Макрорестрикционный анализ ДНК микроорганизмов с использованием гель-электрофореза в пульсирующем поле (PFGE-ти-пирование, пульс-электрофорез) используется в молекулярной биологии для изучения клональной структуры и типирования возбудителей инфекционных заболеваний. Гель-электрофорез в пульсирующем поле (пульс-электрофорез; англ. Pulsed Field Gel Electrophoresis; PFGE) - один из широко используемых в молекулярной биологии методов, позволяющих за счет периодически изменяющегося направления напряженности электрического поля, прилагаемого к агарозной пластине с нанесенными на нее образцами, разделять фрагменты ДНК большого размера (от нескольких сотен тыс.пар нуклео-тидов - т.п.н. - до нескольких млн п.н.) [28]. В настоящее время метод пульс-электрофореза сохраняет свою актуальность и находит применение в различных фундаментальных и прикладных областях молекулярной биологии и генетики.

В частности, пульс-электрофорез применяется для кариотипирования низших эукариот, геномного картирования бактерий, грибов, хромосом высших эукариот, анализа геномных библиотек, в таксономических исследованиях [27].Одной из основных прикладных областей применения пульс-электрофореза является молекулярное типирование возбудителей инфекционных заболеваний бактериальной природы -PFGE-типирование или макрорестрикционный анализ ДНК. Этот подход основывается на сравнительном анализе паттернов рестрикции, полученных при обработке хромосомной ДНК микроорганизма редкощепящими эндонуклеазами. Сравнение рестрикционных паттернов позволяет определять степень родства исследуемых штаммов и на основании этого устанавливать вероятные источники, пути, факторы передачи и распространения инфекции, а также в ряде случаев проводить филогенетический анализ и реконструировать эволюционную историю патогена.

Собственно процедура молекулярного типирования с использованием пульс-электрофореза состоит из нескольких этапов. На первом этапе осуществляется подготовка препарата ДНК, заключающаяся в иммобилизации микробных клеток исследуемого штамма с заданной концентрацией в блоки из легкоплавкой агарозы, что предотвращает фрагментацию молекул нуклеиновой кислоты. Далее агарозные блоки с иммобилизованными клетками подвергаются лизису с последующей отмывкой от клеточного дебриса. На следующем этапе ДНК в агарозных блоках обрабатывается эндонуклеазами рестрикции. Выбор фермента для макрорестрикционного анализа основывается на структурных особенностях генома исследуемого микроорганизма, таких как наличие и частота встречаемости специфического сайта рестрикции, общий нуклеотидный состав. Как правило, используются эндонуклеазы с сайтом узнавания 6 п.н. и более, при этом формируется до 30 фрагментов рестрикции в диапазоне от 20 до 600 т.п.н., что считается достаточным для проведения сравнительного анализа паттернов. Этап разделения полученных рестриктов выполняется в специальной камере, геометрия электродов которой позволяет менять вектор электрического поля. Программируемый процессор дает возможность настройки основных параметров электрофореза (угол между векторами электрического поля, интервал переключения, напряженность, общее время электрофореза) в зависимости от диапазона длин разделяемых фрагментов ДНК.

Заключительный этап предусматривает визуализацию, регистрацию результатов пульс-электрофореза с использованием видеодокументирующих систем, оснащенных соответствующим программным обеспечением. Идентификация размеров рестриктов в индивидуальном паттерне каждого штамма осуществляется на основании сопоставления их с рекомендованным PulseNet размерным стандартом (Xbal-генерированным паттерном рестрикции ДНК штамма Salmonella serovar Braenderup H98124) или ДНК фага ламбда. Очевидно, что при интерпретации данных следует учитывать множество других факторов, таких как биологические особенности исследуемого микроорганизма, длительность вспышки, результаты эпидемиологического анализа. В случае недостаточной эффективности внутривидовой дифференциации штаммов и проблем с интерпретацией результатов при использовании одного фермента рестрикции рекомендуется применить дополнительные эндонуклеазы (что может способствовать повышению дискриминирующей способности PFGE) либо дополнить анализ другими методами молекулярно-генетического типирования [5, 8].

 К недостаткам процедуры молекулярного типирования с использованием пульс-электрофореза можно отнести продолжительность проведения (2-3 дня), применение высококачественных реактивов, строгое соблюдение стандартных протоколов исследования на каждом этапе для обеспечения возможности внутри - и межлабораторного сопоставления результатов, существование нетипируемых штаммов, отсутствие связи между размерами и распределением рестрикционных фрагментов в паттерне с их нуклеотидной последовательностью. Также предъявляются высокие требования к квалификации специалистов. Достоинствами метода являются высокая дискриминирующая способность, возможность биоинформационного анализа результатов, корреляция их с эпидемиологическими данными, что дает основание рассматривать его в качестве эффективного инструмента молекулярного типирования микроорганизмов, в том числе и возбудителей особо опасных инфекций.

В международном масштабе исследования возбудителей бактериальных инфекций методом пульс-электрофореза организуются посредством глобальной международной лабораторной сети PulseNet [2]. Разработанные стандартные протоколы пробоподготовки для разных видов микроорганизмов, рекомендованные эндонуклеазы рестрикции, программы электрофореза, алгоритмы анализа и интерпретации полученных электрофоретических паттернов, использование общих контрольных и стандартных штаммов, а также система обмена и хранения полученной информации позволяют осуществлять глобальный мониторинг за возбудителями инфекционных болезней и проводить сравнительный анализ результатов.