Глава 3. Идентификация патогенных бактериальных штаммов золотистого стафилакокка

Описание возбудителя

Проведение исследования Дрим-методом

Поиск in silico, используя компьютерную программу [9], доступную на сайте http://insilico.ehu.es/ в отношении золотистого стафилококка позволил подобрать фермент рестрикции Cfr 9I (Thermo Fisher Scientific™), который можно использовать в качестве продуцента фрагментов ДНК с усеченными концами. Программа позволяет проводить симуляцию эксперимента. Для этого необходимо выбрать опцию «DDSL», далее выбрать две эндонуклеазы рестрикции. Программа рассчитывает теоретическое количество фрагментов ДНК и их распределение в агарозном геле при генотипировании.

Естественно, реальное распределение фрагментов на полевых изолятах отличается от теоретически ожидаемой картины, получаемой на референтном штамме из базы данных NCBI секвенированных геномов бактерий. В качестве второй эндонуклеазы рестрикции оптимальным оказался фермент Hae II (Thermo Fisher Scientific™). В связи с тем, что геномы многих бактериальных видов секвенированы, использование программы «in silico» позволяет узнать число сайтов рестрикции: Cfr 9I – 39 сайтов, Hae II – 1000. Эти значения оптимальны с точки зрения получения фрагментов ДНК, которые могут быть разделены и визуализированы в обычном агарозном геле.  

Геномную ДНК S. aureus выделяли общепринятыми методамис использованием лизостафина и фенольно-хлороформенной экстракции. Микроорганизм был выделен из инфицированных  животных.

Реакция ДРИМ проводилась в одной микропробирке, куда вносили исследуемую ДНК (0.5-1 мкг), две эндонуклеазы рестрикции (по 5 е.а. на одну реакцию), Taq-полимеразу (0.05 е.а.), Bio-14-dCTP (0.1 мкМ). Общий объем смеси составлял 20 микролитров. Инкубация проводилась в течение 1–2 часов при 37°С. Затем полученные фрагменты ДНК разделяли по размеру электрофорезом в обычном 0.8% агарозном геле. Сразу же после завершения электрофореза ДНК переносили на нейлоновый фильтр Hybond N (GE Healthcare™).

Процесс длился 30-60 минут и проводился в дистиллированной воде на приборе вакуумного переноса VacuGene XL Vacuum Blotting System™ (Amersham Biosciences™). Фрагменты ДНК на фильтре визуализировали в цветной реакции с применением конъюгата стрептавидин-щелочная фосфатаза (Streptavidin-AP, Bio-Rad™) и двух коммерчески доступных красителей NBT и BCIP (Thermo Fisher Scientific™).