Перенос генов в клетки других организмов

Известны многочисленные методы, с помощью которых можно внедрить чужеродную ДНК в геном того или иного организма.

В качестве реципиентов, в геном которых встраиваются чужеродные гены, используют клетки культуры, эмбриональные клетки млекопитающих, некоторых растений, дрозофилы, пронуклеусы млекопитающих, у растений - протопласты, изолированные клетки и ткани, микроспоры, незрелые зиготические зародыши.

Микроинъекция. С помощью тонких стеклянных микропипеток (диаметром 0,1 — 0,5 мкм) и микроманипулятора можно ввести в ядро клетки млекопитающих векторную ДНК с включенным в нее трансгеном. Эффективность (частота интеграции трансгена в геном) такой трансформации достигает 50 %, т. е. в 50 из 100 инъецированных клеток происходит трансформация. Число молекул ДНК, вводимых за одну инъекцию, колеблется от 100 до 300 000.

Для микроинъекций в клетки растений используются микроиглы с наружным диаметром 2 мкм. Трансформация растительных клеток происходит с эффективностью 10 — 20% независимо от типа вектора.

Электропорация. Метод основан на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран.

На растительные протопласты (или животные клетки) и находящуюся в окружающей среде ДНК действуют высоковольтным импульсом (200 — 350 В, длительность 54 мс). Через образующиеся на короткое время поры ДНК проникает в клетку.

Трансфекции. Это встраивание чужеродной ДНК в культивируемые эукариотические клетки в результате обработки их изолированной ДНК. Эффективного поглощения ДНК удалось достичь при добавлении к ней ионов кальция. Предполагают, что клетки преимущественно поглощают частицы кальциевого преципитата ДНК по механизму фагоцитоза, а затем небольшая часть проникших в клетку молекул встраивается в хромосомную ДНК.

Упаковка в липосомы. Это один из методов, используемых для защиты трансформирующего генетического материала от разрушительного действия нуклеаз, присутствующих вне клеток. Липосомы — это сферические образования, оболочки которых состоят из фосфолипидов и внутри которых располагается трансформирующая ДНК. Липосомы захватываются клетками, и ДНК попадает внутрь.

Бомбардирование микрочастицами. Это один из самых эффективных методов трансформации однодольных растений. В качестве исходного материала для трансформации берется суспензионная культура, каллусная ткань или 4 — 5-дневные культивируемые незрелые зародыши однодольных. Для бомбардирования используют частицы золота или вольфрама размером 0,6 — 3 мкм, на которые наносится

ДНК вектора, содержащего необходимый для трансформирования трансген. Этими частицами заряжают «генные пушки», после выстрелов из которых частицы, содержащие гены, проникают в клетки и ядра. Клетки в направлении выстрела чаще всего гибнут, в то время как в зоне 0,6-1 см от центра находятся наиболее удачно трансформированные клетки. Частицы могут проникать на глубину 2 — 3 клеточных слоев.

Генная терапия

Первая успешная попытка применить генотерапию в клинической практике была предпринята в 1990 г. в США. Ребенку, страдающему тяжелым комбинированным иммунодефицитом, связанным с дефектом гена, кодирующего аденозиндезаминазу, была введена неповрежденная копия гена. Извлеченные у больного клетки (Т-лимфоциты крови) культивировали в пробирке, при помощи ретровирусного вектора вводили неповрежденный ген аденозиндезаминазы и возвращали клетки больному.

На сегодняшний день поддаются излечению с помощью трансгенеза уже около 10 болезней человека.

К числу важных практических достижений генной инженерии следует также отнести создание диагностических препаратов. На сегодняшний день в медицинскую практику введено более 200 новых диагностикумов.