Понятие о векторах. Векторы на основе плазмид и ДНК фагов

При наличии выделенного гена его надо доставить в клетку, наследственность которой предстоит изменить. Основным способом такой доставки служит использование рекомбинантных молекул ДНК плазмид. Рекомбинантными, или гибридными, плазмидами называют их искусственные формы, сочетающие или гены от разных плазмид, или плазмиды, несущие гены, выделенные из хромосом прокариот или эукариот. Современная генная инженерия берет свое начало в 1972 г., когда П. Берг и сотрудники создали новую рекомбинантную плазмиду. Эта плазмида содержала ДНК вируса SV40, дефективного фага лямбда и галактозного оперона Е. coli.

Рекомбинантная плазмида с включенным в нее участком чужеродной ДНК становится «плазмидным вектором».

Введение в клетку и последующее размножение рекомбинантной плазмиды обеспечивают клонирование приобретенного ею чужеродного фрагмента ДНК.

В качестве векторов используется ряд природных плазмид, а также векторы, искусственно сконструированные с помощью рестриктаз и лигаз. Среди природных плазмид широко применяется колициногенная плазмида ColEi. При добавлении к культуре бактерий хлорамфеникола она амплифицируется до 1000 копий на одну клетку Е. coli. Вместе с плазмидой в клетке клонируется и введенный в плазмиду фрагмент чужеродной ДНК. Известно более 30 систем рестрикции, которые позволяют получать самые различные структуры векторов.

В клетки млекопитающих внедряется онкогенный обезьяний вирус SV40, его используют для внесения в эти клетки чужеродной ДНК. Кроме того, этот вирус способен давать псевдовирионы, которые в своей белковой оболочке (капсиде) несут не геном вируса, а фрагмент ДНК той клетки, в которой происходило образование псевдовириона.

В 1980 г. ген инсулина человека, введенный в клетки бактерий, кодировал в них синтез человеческого инсулина. Этот инсулин прошел испытания на людях и оказался очень эффективным. Инсулин, который в клетках бактерий кодировался человеческим геном, не вызывает побочных явлений, что свойственно инсулину, получаемому из поджелудочных желез свиней.

В 1980 г. через плазмиду pBR322 в клетку кишечной палочки С. Нагата и сотрудники, а также Д. Гёддель и сотрудники ввели ген лейкоцитарного интерферона. В 1981 г. Т. Танигучи и сотрудники ввели в Е. coli ген фибробластного и в 1982 г. П. Грей и сотрудники - ген иммунного интерферона. Были получены линии бактерий, продуцирующие интерферон. Для интерферона типа а-F его продукция была получена в клетках Е. coli. Эта задача в 1982 г. была решена Ю. А. Овчинниковым и сотрудниками.

Геномные библиотеки. Способы получения рекомбинантных молекул ДНК, методы клонирования генов.

Путем генетической инженерии создаются банки генов разных организмов — человека, дрозофилы, вирусов, бактерий, дрожжей, мыши, шпорцевой лягушки и др. Каждый банк — это коллекция гибридных молекул ДНК, в которые входят гены данного вида организмов. В идеале банк должен содержать все гены. Гибридные молекулы создаются на основе ДНК плазмид, бактериофагов, представляющих собой их гибриды. Широко используются ДНК из плазмид Со1Е1 ДНК фага лямбда.

Сотни и тысячи генов порознь встраиваются в плазмиды и другие векторы и хранятся в замороженном состоянии. Такие банки генов позволяют исследовать организацию геномов разных форм и при необходимости дают материал для генно-инженерных работ.

Получение с помощью генетической инженерии трансгенных организмов

Генно-инженерные работы выполняются в несколько этапов.

1. Получают нужный ген, готовый для последующих процедур трансгенеза.

2. Подбирают вектор, обладающий всеми необходимыми характеристиками.

3. Вектор и клонируемый ген обрабатывают одинаковыми рестриктазами.

4. Сшивают вектор и встроенный ген с помощью ДНК-лигазы.

5, Вводят рекомбинантную конструкцию из вектора и встроенного гена в клетки-мишени реципиента — осуществляют трансформацию.

6.Проверяют наличие трансгена в клетках- мишенях. Для этого используют маркерные гены, которые находятся в молекуле-векторе наряду с трансгеном. Это гены, контролирующие устойчивость к антибиотикам или гер-бицидам. Поэтому на фоне соответствующих гербицидов или антибиотиков будут развиваться только тезслетки, которые содержат гены ycтойчивости к ним, т. е. вектор со встроенным в него трансгеном.