Методические указания

Лабораторная диагностика холеры

 

Задания для выполнения лабораторной работы

1. Указать материал для исследования.

2. Бактериологическая диагностика холеры.

а) изучить морфологические и тинкториальные свойства: микроскопировать готовые мазки из исследуемой культуры больного;

б) изучить антигенные свойства: отметить результаты развернутой реакции агглютинации с диагностической O1-сывороткой;

в) отметить наличие или отсутствие роста исследуемой культуры на среде с полимиксином и результаты гексаминового теста. Дать заключение по проведенным исследованиям.

 

Методические указания

Материал для исследования: испражнения больного, рвотные массы, вода, пищевые продукты; при постмортальной диагностике: отрезки тонкой кишки и желчный пузырь с частью печени. При необходимости хранения материал помещают в транспортную среду (буферный солевой раствор с глицерином). Для длительного сохранения рекомендуется полоску фильтровальной бумаги, смоченную в жидких испражнениях, поместить в герметически закрытый пластиковый контейнер - для предохранения от высыхания. Таким образом возбудитель сохраняется в материале до 5 нед.

Бактериоскопическое исследование. Из исследуемого материала готовят мазки, окрашивают их по методу Грама и водным фуксином. Кроме того, из нативного материала готовят препарат "висячая" капля, в котором определяют наличие подвижных вибрионов при темнопольной или фазово-контрастной микроскопии. Обнаружение в мазках большого количества грамотрицательных, слегка изогнутых палочек (длиной от 1,5 до 3 мкм) и активно-подвижных вибрионов в препарате "висячая" капля позволяет дать первый предварительный положительный ответ.

Бактериологическое исследование. Материал засевают в различные жидкие и плотные элективные среды, в частности во флаконы со щелочной пептонной водой (1% с теллуритом) и на чашки со щелочным питательным агаром. Посевы на пептонной воде инкубируют при 37 °С в течение 5-6 ч, на чашках – 10-12 ч. Из голубоватой пленки, образующейся на пептонной воде, или из ее поверхностного слоя делают мазки и препараты "раздавленная" и "висячая" капля. Этот же материал используют для постановки реакции агглютинации на стекле со специфической противохолерной О1-сывороткой. Часть пептонной воды переносят в другую пробирку для постановки нитрозоиндоловой пробы. Для этого добавляют туда же несколько капель серной кислоты. В положительном случае появляется розовое окрашивание вследствие образования нитрозоиндола под влиянием холерного вибриона. Независимо от результатов исследования делают пересев на вторую пептонную воду. Наличие грамотрицательных вибрионов, агглютини-рующихся О1-сывороткой, позволяет дать второй предварительный ответ. Независимо от полученных результатов продолжают исследование (схема 7).

Выделение чистой культуры и ее идентификацию проводят по 5-6 однотипным колониям, выросшим на щелочном агаре. Для ускорения хода анализа ставят развернутую реакцию агглютинации с бактериальной суспензией, приготовленной из колоний. Для этого агглютинирующую О1-сыворотку разводят в пробирках до титра пептонной водой (в объеме 0,5 мл). Затем в каждую пробирку вносят 1-2 капли суспензии бактерий. Результат реакции агглютинации учитывают после 3-4-часовой инкубации при 37 °С.

Реакция Фогеса-Проскауэра: вибрионы выращивают в глюкозофосфатном бульоне, затем добавляют реактив альфа-нафтол в растворе щелочи; при наличии ацетилметилкарбинола наблюдается рубиново-красное окрашивание среды.

Гексаминовый тест: культуру выращивают на бульоне с глюкозой, гексамином (уротропином) и индикатором бромтимоловым синим. В положительном случае через 6-8 ч наблюдается изменение зеленого цвета среды в желтый.

Таким образом, идентификацию культур проводят в три этапа: 1) устанавливают их принадлежность к роду Vibrio; 2) дифференцируют их от холероподобных вибрионов в реакции агглютинации с O1-сывороткой, по чувствительности к специфическому фагу и другими тестами; 3) определяют видовые признаки культур. Окончательное заключение о выделении и дифференцировании холерных вибрионов дают через 36-48 ч на основании комплексного изучения основных биологических признаков возбудителя.

Трудности при оценке результатов бактериологического исследования встречаются при выделении атипичных холерных вибрионов и в первую очередь не агтлютинирующихся холерной O1-сывороткой (НАГ-вибрионы). НАГ-вибрионы могут лизироваться одним из специфических холерных фагов и обладать другими свойствами, сходными с холерными вибрионами.

Идентификацию культуры проводят на основании определения чувствительности вибрионов к холерному фагу, агглютинабельности противохолерной О1-сывороткой и типовыми агглютинирующими сыворотками Инаба и Огава, их гемолитических и биохимических свойств (оксидазная активность декарбоксилазы аминокислот, ферментация углеводов, образование ацетилметилкарбинола и др.).

Экспресс-методы диагностики: иммобилизация вибрионов холерными сыворотками и типовыми холерными фагами. Капли испражнений или материала с поверхности пептонной воды обрабатывают холерной O1-сывороткой, типовыми сыворотками Огава и Инаба или типовыми холерными фагами. Готовят из них препараты "раздавленная" капля, которые исследуют с помощью темнопольной и фазово-контрастной микроскопии. В положительном случае через 3-5 мин движение вибрионов прекращается.

Иммунохимические исследования. Применяют метод прямой ИФ. Мазки из исследуемого материала обрабатывают флюоресцирующей противохолерной сывороткой и исследуют в люминесцентном микроскопе. Положительным результатом считается обнаружение в препарате даже единичных вибрионов с ярким желто-зеленым свечением в виде блестящего ободка по периферии клетки. Положительный результат можно получить через 1-2 ч после начала исследования при концентрации вибрионов не менее 10⁶ клеток в 1 мл, поэтому рекомендуется предварительное подращивание материала на питательных средах.

Биохимические и молекулярно-биологические исследования. В случае обнаружения соответствующих молекул ДНК в исследуемом материале в ходе в результате проведения ПЦР-анализа можно поставить предварительный диагноз.

Серодиагностика. Выявление антител к возбудителю является вспомогательным и применяется для ретроспективной диагностики холеры, выявления вибрионосителей и оценки напряженности постинфекционного и поствакцинального иммунитета. Для этого обычно ставят реакцию агглютинации или РНГА, диагностический титр антител в этих реакциях 1:80-1:320, а также определяют вибриоцидные антитела в реакции лизиса.