Дополнительная литература

1. Номенклатура ферментов. – М.: ВИНИТИ, 1979. – 320 с.

2. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. – М.: Высшая школа, 1980. – 272 с.

3. Скоупс Р. Методы очистки белков. – М.: Мир, 1985. – 358 с.

4. Варфоломеев С. Д., Гуревич К. Г. Биокинетика. – М.: ФАИР-ПРЕС, 1999. – 720 с.

5. Плакунов В.К. Основы энзимологии. – М.: Логос, 2001. – 128 с.

6. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии. – М.: Мир, 1989. В 2-х томах.

7. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. – М.: Мир, 2002. – 589 с.

 

 

Экспериментальная часть

Амилаза слюны (КФ 3.2.1.1) – простая и доступная модель, для освоения основных приемов работы с Е. Соответственно схеме (рис. 2), в физиологических условиях она ведет ступенчатый эндогидролиз α-1,4-гликозидных связей в полиозах. Об этом можно судить по убыли реакции с йодом или нарастанию восстанавливающей способности сахаров, содержащих свободный полуацетальный гидроксил, например, с помощью качественных реакций Троммера, Бенедикта и др.

 

 

Рис. 2. Схема ступенчатого гидролиза полиоз под действием эндоамилаз слюны и поджелудочной железы

 

1. Получение разведенного препарата амилазы слюны

1. Студент-доброволец из пары, ополоснув рот водой 2-3 раза, собирает в пробирку до 1 мл слюны.

2. Под контролем лаборанта, отобрать точно 1 мл слюны в чистую пробирку.

3. Добавить в пробирку 9 мл воды, таким образом разводя слюну в 10 раз.

 

Количественное определение активности амилазы слюны

Способом Вольгемута

Принцип метода: Основан на последовательном разведении препарата амилазы водой с помощью «переката», после чего во все пробирки добавляют равные количества субстрата: раствора крахмала и инкубируют их при постоянной температуре. Окончив инкубацию, останавливают процесс гидролиза и, с помощью раствора йода, как индикатора на крахмал, выявляют наличие субстрата в пробирках. Зависимость между этими величинами (Жеребцов и др., 2002) сведена в таблицу:

 

Цвет и глубина окраски	Синяя	Фиолетовая	Красная	-
Степень полимеризации	>45	35-45	20-30	<12

Ход работы: 1. В соответствии с протоколом опыта, оформленным в виде таблицы:

 

№ пробирок	1	2	3	4 и т.д
Разведение слюны	1:20	1:40	1:80	и т.д.
Окраска с йодом
Активность фермента

 

1. в 10 пронумерованных пробирок разлить точно по 1 мл воды.

2. Добавить в первую пробирку 1 мл слюны с разведением в 10 раз и, избегая вспенивания, хорошо перемешать раствор с помощью пипетки.

3. Той же пипеткой перенести 1 мл содержимого из первой пробирки во вторую, из второй – в третью и т.д., каждый раз, тщательно перемешивая их содержимое. Закончив «перекат», удалить из последней (десятой) пробирки 1 мл смеси.

4. Во все пробирки с полученной серией разведений слюны добавить точно по 2 мл 0,1 % раствора крахмала, тщательно перемешивая их содержимое.

5. Пометить свой штатив и поместить его в водяную баню с качалкой при 40 ºС (313 К), оставив для инкубации точно на 30 мин.

6. По истечении времени инкубации, вынуть свой штатив с пробирками из бани и, тут же охладить его водой из под крана, в течение 1-2 мин.

7. В каждую пробирку добавить по 1-2 капли раствора Люголя (1 % раствор йода в 2 % растворе иодида калия), в качестве индикатора на крахмал.

8. Содержимое пробирок перемешать и, наблюдая развитие окраски, занести результаты в таблицу протокола опыта.

9. Рассчитать активность амилазы (Е/л) в пробах по следующей формуле:

где а – разведение слюны в последней пробирке с желтой окраской;

0,002 – количество грамм крахмала в пробе;

1000 – коэффициент пересчета миллилитров в 1 л;

30 – время инкубации в минутах;

60 – коэффициент пересчета минут в секунды.

 

10. Занести результаты расчетов в таблицу протокола.

В норме, активность амилазы в слюне человека 3-7 нкат/л. Однако, существенной диагностической ценности она не имеет.