Определение активности каталазы по А.Н. Баху и А.И. Опарину

Каталаза фермент – фермент класса оксидоредуктаз, катализирующий реакцию разрушения ядовитого для клеток пероксида водорода на воду и кислород:

2Н₂О₂ = 2Н₂О + О₂

Метод основан на определении количества пероксида водорода, расщепленного в процессе инкубации с ферментом. Количество пероксида водорода в реакционной смеси определяется методом перманганатометрического титрования, в основе которого лежит следующее уравнение реакции:

5Н₂О₂ + 2KMnO₄ + 3H₂SO₄ = 2MnSO₄ + K₂SO₄ +5O₂ + 3H₂O

Ход работы:

2-3г сырого картофеля, тщательно растереть в ступке с кварцевым песком. Для уменьшения кислотной реакции добавить немного карбоната кальция до прекращения выделения пузырьков углекислого газа. При растирании в ступки порциями добавить 40-50 мл воды. Растертую массу перенести в колбы и довести объем до 100 мл. Перемешать и смесь оставить на 10-15 мин, потом профильтровать.

В две колбы для титрования ёмкости 150-200 мл внести по 20 мл полученного фильтрата. Содержимое одной колбы прокипятить в течение 1 мин и охладить до комнатной температуры (контрольная проба).

Другая колба (опытная) содержит активный. К содержимому опытной и контрольной пробы прилить по 20 мл воды и 3 мл 1% раствора пероксида водорода. Тщательно перемешать и оставить при комнатной температуре 30 мин.

По окончании инкубации в обе колбы добавить по 5 мл 10% раствора серной кислоты, перемешать и избыток пероксида водорода в каждой колбе оттитровать 0,02 М раствором перманганата калия до образования устойчивого в течение 1 минуты розового окрашивания.

Активность каталазы выразить в мкмоль пероксида водорода, расщепившегося под действием фермента в расчёте на 1,0 г исследуемого биологического материала (или на 1мг вытяжки из него) за 1 минуту.

Вычисление провести по формуле:

где Х – активность каталазы, Е/г

(V₁ – V₂) – разность между объёмами 0,02М р-ра перманганата калия, пошедшего на титрование контрольной (V₁) и опытной (V₂) проб в мл;

Т – титр применяемого для титрования 0,02М р-ра перманганата калия 1,7 мг (или 0,0017);

50 – коэффициент пересчёта на мкмоль Н₂О₂;

100 – общий объём приготовленной вытяжки, мл;

m – масса взятого для анализа биологического материала, мг;

20 – объём фильтрата, взятого для анализа биологического материала, г;

30 – время инкубации, мин.

Активность каталазы можно определить и по объёму кислорода, выделившегося после прибавления к исследуемому материалу пероксида водорода. Этот метод используется для определения активности каталазы в молоке, выражаемую каталазным числом, представляющим собой объём кислорода (мл), выделившийся за 2 часа при 25 ⁰С из добавленных к 15 мл молока 5 мг 1% р-ра Н₂О₂. Молоко от здоровых животных выделяет 0,7 – 2,5 мл кислорода, т.е. каталазное число натурального молока составляет не более 2,5. Молоко, полученное от больных животных (мастит и др.), и молозиво имеют повышенное каталазное число, доходящее до 15.