Глава 2. Материалы и методы исследования

Материалы исследования

Активность ферментов определяли в плацентарной ткани, полученной сразу после родов при соблюдении холодового режима. Ткани взвешивали, навески гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком. Для определения активности КПН, ФМСФ-КП при гомогенизировании использовали 10 мМ натрий-ацетатный буфер (рН 5,6), содержащий 50 мМ NaCl, в соотношении 1:50 (вес:объем), каталазы -, в соотношении 1:5, церулоплазмина -, в соотношении 1:5. В работе использовали реактивы: ацетат натрия («MERCK», Германия), ФМСФ («Serva», США), ГЭМЯК (любезно предоставлена доктором О.Л. Варламовым), субстраты – дансил-фен-ала-арг, дансил-фен-лей-арг, синтезированные к.х.н. В.Н. Калихевичем. Все остальные реактивы были отечественного производства с квалификацией «ХЧ» и «ОСЧ».

 

Клинические группы

 Было обследовано 19 образцов плацентарной ткани женщин в возрасте от 20 до 35 лет. Родильницы были разделены на 2 клинические группы. В І группу (контрольную) вошли женщины с физиологическим течением беременности и родов. У всех женщин беременность закончилась срочными родами (срок родов колебался от 38 до 40 недель). Околоплодные воды были светлые. Все дети родились в удовлетворительном состоянии со средней оценкой по шкале Апгар на 1-й минуте – 8,2, на 5-й минуте жизни – 8,6. При гистологическом исследовании последов отмечены умеренно-выраженные компенсаторно-приспособительные процессы.

ΙΙ группу составили пациентки с ОПГ-гестозом легкой степени тяжести. У всех женщин беременность закончилась срочными родами (срок родов колебался от 38 до 40 недель). Околоплодные воды были светлые. Средняя оценка новорожденных по шкале Апгар на 1-й минуте составила – 8,2, на 5-й минуте жизни – 8,4.

Диагноз поставлен на основании клинических проявлений, клинико-лабораторных данных; оценку степени тяжести гестоза проводили по унифицированной шкале Гоека-Савельевой. При гистологическом исследовании последов в данной группе обнаружены умеренно-выраженные компенсаторно-приспособительные процессы, в некоторых случаях отмечены очаговые нарушения микроциркуляции, инволютивно-дистрофические изменения, признаки инфекции.

Методы исследования

 

Метод определения активности основных карбоксипептидаз

Активность КПН определяли флюорометрическим методом Fricker и Snyder [153].

Для определения активности КПН 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл (в случае опытной пробы) 50 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 50 мМ NaCl, или к смеси 140 мкл вышеуказанного буфера и 10 мкл 25 мкМ водного раствора ингибитора ГЭМЯК (в случае контрольной пробы). Далее пробы преинкубировали 8 минут при 37˚С. Реакцию начинали прибавлением 50 мкл предварительно нагретого до 37˚С 210 мкМ раствора дансил-фен-ала-арг, приготовленного на воде (конечная концентрация в реакционной смеси 42 мкМ). Пробы инкубировали 60 минут при 37˚С. Реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 1М раствора HCl.

Для экстракции продукта реакции дансил-фен-ала к пробам приливали по 1,5 мл хлороформа, интенсивно встряхивали в течение 60 с. Хлороформную и водную фазы разделяли центрифугированием в течение 10 минут при 1000 об/мин.

Измерение флюоресценции хлороформной фазы проводили на флюориметре ФМЦ-2 при λ_ex=360 нм и λ_em=530 нм в кювете толщиной 1 см. В качестве стандарта использовали 1 мкМ раствор дансил-фен-ала в хлороформе.

Активность фермента определяли как разность прироста флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ГЭМЯК, и выражали в нмоль дансил-фен-ала, образовавшегося за 1 минуту инкубации в пересчете на 1 мг белка.

Для определения активности ФМСФ-ингибируемой КП 50 мкл гомогената ткани добавляли к 150 мкл (в случае опытной пробы) 50 мМ натрий-ацетатного буфера, рН 5,6, содержащего 50 мМ NaCl, или к смеси 140 мкл вышеуказанного буфера и 10 мкл 25 мМ ингибитора ФМСФ, приготовленного на этаноле, который добавляли после смешивания гомогената ткани с буфером (в случае контрольной пробы). Пробы преинкубировали 8 мин при 37˚С, затем вносили 50 мкл предварительно нагретого до 37˚С 210 мкМ раствора дансил-фен-лей-арг, приготовленного на воде. Далее пробы обрабатывали как описано для КПH. Активность фермента определяли как разницу в приросте флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих ФМСФ и выражали в нмоль дансил-фен-лей, образовавшегося за 1 мин инкубации в пересчете на 1 мг белка.

 Концентрацию белка оп­ределяли методом Лоури [80].

 

Метод определения каталазы

В две колбы наливали по 7 мл дистиллированной воды и добавляли в них по 1 мл гомогената. Содержимое кипятили 2 - 3 мин. В обе вносили по 2 мл 1% H2O2 и оставляли на 30 мин при комнатной температуре. Затем приливали по 5 мл 10% H2SO4 и оттитровывали содержимое 0,05н KMnO4 до розового цвета.

Расчет: 1мл 0,05 н KMnO4 — 0,85 г H2O2. Таким образом, разницу в результатах титрования контроля и опыта умножаем на эту величину, получали количество мг перекиси.