Основные карбоксипептидазы

Основные карбоксипептидазы - пептидгидролазы, отщепляющие остатки основных аминокислот (аргинина и лизина) с С-конца пептидов. Им принадлежит важная роль в регуляции уровня биологически активных пептидов в организме [11,12] при различных физиологических и патологических процессах [11,12].

Карбоксипептидаза H

Карбоксипептидаза Н (карбоксипептидаза Е, энкефалинконвертаза, КФ 3.4.17.10) – впервые выделена и очищена в 1982 году Фрикером и Снайдером из хромаффинных гранул надпочечников быка, как фермент, образующий энкефалины из их предшественников [63]. КПH – одноцепочечный гликопротеин, экзопептидаза секреторных везикул. Фермент представлен во всех органах и тканях как в растворимой, так и в мембраносвязанной формах. Синтезируется в виде неактивного зимогена с Mr 75000, который превращается в активную форму под действием трипсиноподобных ферментов в ходе созревания секреторных везикул.

КПН – тиол-зависимый цинк-металлофермент. pH оптимум соответствует pH внутри секреторных гранул – 5,5–6,0. Активаторами фермента являются ионы Со²⁺, Ni²⁺, ингибиторами – Сd²⁺, Cu²⁺, хелатирующие агенты: ЭДТА, о-фенантролин; реагенты на сульфгидрильные группы: ПХМФС, ПХМБ, N-этилмалеимид; органические кислоты, содержащие амино- или гуанидиновую группу: ГЭМЯК, ГПЯК, АПМЯК, АПЯГ, МГТК. Наиболее эффективными ингибиторами являются ГЭМЯК и ГПЯК с К_i 8,8 и 7,5 нМ соответственно.

Высокая активность фермента выявлены в мозге, гипофизе, хромафинных гранулах надпочечников, эндокринных клетках поджелудочной железы, плаценте [20]. Плацентарная КПН локализована в наружных ворсинках трофобласта, утероплацентарных васкулярных эндотелиальных клетках, ворсинках хориона, амниотических эндотелиальных клетках, гладких мышечных клетках пупочных сосудов (вены и артерий) [20]. Ассоциирована со структурными элементами ЭПР (в гладких мышечных клетках сосудов пуповины), комплекса Гольджи и секреторными везикулами, где протекает процессинг предшественников различных биологически активных пептидов. Фермент обнаружен в секреторных везикулах, содержащих энкефалины, атриальный натрийуретический фактор [78,80], глюкагон [77, 81], инсулин, АКТГ, пролактин [65], вещество P, вазопрессин и окситоцин и другие регуляторные пептиды.

Плацента, являясь эндокринным органом, продуцирует белковые гормоны, которые, участвуют в формировании и поддержании гомеостаза матери и плода. Кроме того, пептиды вовлекаются в патогенез гестационных осложнений. Поэтому изучение активности карбоксипептидазы Н в плацентарной ткани ОПГ-гестозах представляет актуальность.

  1.4.1.2. ФМФС-ингибируемая карбоксипептидаза

В 1995 г. Генгин, Вернигора и соавт. обнаружили в растворимой фракции серого вещества головного мозга котов основную КП [], активность которой полностью подавляется ФМСФ [42]. Позднее фермент был обнаружен во всех отделах мозга и практически во всех тканях и органах крыс.

По результатам гель-фильтрации, данный фермент имеет Мr 100000 – 110000. pH оптимум – 6,0–6,5. Активность ФМСФ-ингибируемой карбоксипептидазы полностью подавляется ингибитором сериновых протеиназ – ФМСФ и реагентом на сульфгидрильные группы – ПХМБ, примерно на 40% фермент ингибировался иодацетамидом. Фермент почти в 2 раза активировался 50 мМ NaCl, несколько слабее – NaBr, KCl и KJ.

По данным тонкослойной хроматографии было обнаружено, что частично очищенный фермент отщеплял аргинин от лей⁵-энкефалин-арг⁶ и дансил-фен-лей-арг с образованием лей⁵-энкефалин и дансил-фен-лей соответственно. Более глубокого гидролиза субстратов не наблюдалось. Фермент также не расщеплял субстрат КПA – карбобензокси-гли-лей [42, 47]. Таким образом, по субстратной специфичности ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза сходна с ЛКПB. Вместе с тем физико-химические свойства фермента (ингибирование ФМСФ, нечувствительность к ЭДТА, ГЭМЯК и ионам Co²⁺) отличают его от ЛКПB. Ингибирование фермента ФМСФ позволяет предположить, что он является сериновой карбоксипептидазой. В тканях млекопитающих обнаружены две сериновые карбоксипептидазы – ЛКПА (КФ 3.4.16.1, катепсин A, лизосомальная карбоксипептидаза L) и карбоксипептидаза C (КФ 3.4.12.4, ангиотензиназа C, пролилкарбоксипептидаза). Но ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза отличатся от карбоксипептидазы C по молекулярной массе и субстратной специфичности.

В то же время, ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза имеет сходные с ЛКПA молекулярную массу, оптимум pH, ингибиторный профиль, но отличается от последней по субстратной специфичности и тканевой локализации.

Обращает на себя внимание тот факт, что сродство обнаруженного фермента к дансил-фен-лей-арг (К_m гидролиза – 48 мкМ), выше, чем сродство КПН (К_m гидролиза – 96 мкМ). Это позволяет предположить, что энкефалин-лей⁵-арг⁶ может быть лучшим субстратом для ФМСФ-ингибируемой КП, чем для КПН. ФМСФ-КП проявляет существенную активность при значениях рН, соответствующих таковому внутри секреторных везикул. Таким образом, возможно, что обнаруженный фермент вовлекается в процессинг нейропептидов. В связи с этим представляет интерес изучение активности ФМСФ-ингибируемой КП в плацентарной ткани в норме и при патологии.