Трансляция у прокариот

Трансляция (от лат. translatio — перевод) — процесс синтеза белка из аминокислот на матрице РНК, осуществляемый рибосомой.

По мРНК движется рибосома и переводит язык триплетов нуклеотидов в язык аминокислот. В активный центр рибосомы поступают тРНК с аминокислотами. При комплементарном взаимодействии антикодона тРНК и кодона мРНК, рибосома присоединяет аминокислоту к синтезирующейся пептидной цепи и продвигается на один триплет вперед по мРНК.

Инициация У прокариот на мРНК есть специальная последовательность, которая называется последовательность Шайна-Дальгарно. Последовательность состоит из шести нуклеотидов AGGAGG. 16S рРНК на 3’-конце содержит комплементарную последовательность CCUCCU. Инициация трансляции происходит во время комплементарного взаимодействия 16S рРНК и мРНК. У прокариот трансляция начинается с триплета ATG. Осуществляется это по следующему механизму. Необходимы специальные факторы инициации трансляции: IF1, IF2-GTP, IF3; кроме того, необходима иницаторная тРНК. IF2 связывается с этой тРНК и с 30S субъединицей рибосомы, далее с этим комплексом связывается 50S субъединица с образованием функциональной рибосомы.

Элонгация Этот этап начинается с момента сборки рибосомы на мРНК. Для понимания работы рибосомы необходимо знать ее активные центры. Ее центры (A, P, E) отвечают за разную работу. Сайт A отвечает за связывание тРНК и мРНК, сайт P — за образование пептидной связи между аминокислотой и пептидом, сайт E участвует в отсоединении тРНК без аминокислоты от рибосомы. Продвижение рибосомы по мРНК осуществляется факторами элонгации трансляции. На сегодняшний день описано три фактора: • EF-Tu связывается с тРНК с аминокислотой и направляет ее в сайт A рибосомы. • Фактор EF-Ts связывается с EF-Tu и освобождает его из рибосомы. Далее осуществляется синтез пептидной связи. • Фактор EF-G катализирует перемещение рибосомы на один триплет мРНК. Транспортная РНК оказывается вне рибосомы и открепляется от мРНК. Далее цикл повторяется.

Терминация  Этот этап также контролируется белковыми факторами трансляции. RF1 узнает кодоны терминации трансляции UAA и UAG, RF2 узнает терминирующие кодоны UAA и UGA. EF3 облегчает работу двух других факторов.

Рестриктазы: виды, особенности

Рестриктазой называется белковый фермент, специфичный для определенной последовательности, и способный эту последовательность разрезать, нарушая целостность ДНК.

Все рестриктазы узнают на двуспиральной ДНК строго определенные последовательности, но рестриктазы 1-го класса осуществляют разрывы в произвольных точках молекулы ДНК, а рестриктазы 2-го и 3-го классов узнают и расщепляют ДНК в строго определенных точках внутри сайтов узнавания или на фиксированном от них расстоянии.

По механизму действия и молекулярной структуре различают три типа рестриктаз.

Рестриктазы І типа являются сложными белками с тремя различными типами субъединиц (рестриктазы ЕсоВ и ЕсоК имеют три субъединицы):

S-субъединица распознает сайт рестрикции;

М-субъединица – фермент метилаза;

R-субъединица – рестриктаза.

Рестриктазы І типа узнают сайт рестрикции, но расщепляют последовательность ДНК на произвольном расстоянии от сайта узнавания (от нескольких десятков до нескольких тысяч пар нуклеотидов).

Второй тип рестриктаз. Механизм действия

Рестриктазы ІІ типа (ЕсоRI,BstI,HindIII,AluI,PstIи др.) – осуществляют только рестрикцию, метилирование производит другой фермент.

Рестриктазы ІІ типа характеризуются тем, что у них сайты узнавания и места рестрикции совпадают.

Сайты рестрикции рестриктаз II типа представлены – палиндромами. Палиндром – это когда в двух цепях ДНК последовательности одинаковые, но идут в противоположных направлениях.

Рестриктазы ІІ типа разрезают ДНК в неметилированных палиндромных сайтах (центральная симметрия с образованием тупых или липких концов).Эти ферменты очень специфичны, используются для рестрикционного анализа ДНК, а также в генной инженерии.

Рестриктазы ІІ типа делятся на несколько классов в зависимости от размера сайта рестрикции и длины получаемых фрагментов ДНК:

1) Мелкощепящие – сайт рестрикции представлен 4 п.н.

2) Среднещепящие – 6-8 п.н.

3) Крупнощепящие – 10-14 п.н.

 

Рестриктазы ІІ типа делятся на 2 группы в зависимости от того, каким образом они расщепляют последовательность ДНК.

Одни из них осуществляют прямой разрез ДНК (по оси симметрии). В результате образуются фрагменты ДНК с тупыми (ровными) концами. Примером таких рестриктаз является эндонуклеаза Bal 1.

Рестриктазы, относящиеся ко второй группе, осуществляют ступенчатый разрез(на некотором расстоянии от оси симметрии). В результате этого в месте разреза образуются неровные (липкие) концы, т. е. рестрикты имеют на своих концах однонитевые взаимно комплементарные участки. Примером таких рестриктаз является фермент EcoR1.

Ферменты второго класса состоят из 2 отдельных белков: рестрицирующей эндонуклеазы и модифицирующей метилазы,

Рестриктазы ІІІ типа ‑ это рестриктазы промежуточного типа. Имеют некоторое сходство с рестриктазами 1-го типа. В состав фермента входит и рестриктаза и метилаза, сайт узнавания находится неподалеку от сайта рестрикции. Для проявления эндонуклеазной активности требуются только АТФ и ионы Mg²⁺. Расщепление ДНК не сопровождается гидролизом АТФ. Гидролизуют ДНК на расстоянии 20 – 39 п.н. от сайтов узнавания и поэтому также довольно редко используются для практических целей.