Клонирование генов в клетках бактерий

Метод клонирования нашел широкое применение. С его помощью
можно получать микробиологическим путем продукты, использующиеся человеком. В настоящее время разработаны методы микробиологическо-
го получения гормона инсулина, в котором нуждаются больные диабе-
том. Раньше его получали путем экстрагирования из поджелудочных же-
лез коров, свиней, что очень сложно и дорого.

Обычно содержание в клетке какого-либо сегмента ДНК, например отдельного гена, очень незначительно. Поэтому для проведения экспериментов с фрагментами ДНК их необходимо многократно копировать (клонировать). В классической методике клонирования ДНК используется способность клеток бактерий поглощать и реплицировать короткие кольцевые молекулы ДНК, известные как плазмиды. Сначала клонируемый фрагмент ДНК вырезается из исходной ДНК с помощью рестриктазы. В качестве переносчика («вектора») служит плазмида с единственным участком, узнаваемым EcoRI. Кольцевая плазмида линеаризуется с помощью EcoRI и затем смешивается с изучаемым фрагментом ДНК. Поскольку фрагмент и вектор имеют одинаковые липкие концы, некоторые из молекул будут гибридизоваться таким образом, что клонируемый фрагмент окажется интегрированным в структуру вектора. Затем концы линейной молекулы ковалентно сшиваются с помощью ДНК-лигазы с образовании новой («рекомбинантной") плазмиды. При обработке большого количества клеток некоторые из них поглощают рекомбинантную плазмиду (так называемая трансформация). Трансформированные клетки реплицируют плазмиду вместе с собственным геномом. Обычно используют плазмиды, придающие трансформированной клетке устойчивость (резистентность) к определенному антибиотику. При инкубации популяции клеток в присутствии антибиотика будут реплицироваться только те клоны, которые содержат плазмиду. Из полученного клона выделяют плазмиду и после расщепления рестриктазой EcoRI получают множество копий клонированного фрагмента ДНК.

3. Ферменты репликации

Молекулярные механизмы репликации бактериальной ДНК сходны в
общих чертах с таковыми у других организмов. Для того чтобы про-
изошла репликация ДНК по полуконсервативному механизму, необхо-
димо, чтобы двухцепочечная молекула ДНК расплелась с образованием
одноцепочечных фрагментов. В этом процессе участвует несколько фер-
ментов, основными из них являются:

1) ДНК-геликазы, перемещающиеся по цепи ДНК в направлении
5′ → 3′ и перемещающиеся в направлении 3′ → 5′;

2) SSB-белки (s ingle s trand b inding – связывающиеся с однонитевой
ДНК), которые связываются с однонитевой ДНК и препятствуют ее ре натурации;

3) ДНК-гиразы, или топоизомеразы, белки, которые снимают напря-
жение при раскручивании кольцевых молекул ДНК и способствуют ее
расплетанию.

На образовавшихся однонитевых участках ДНК идет синтез компле-
ментарных цепей. В этом процессе участвуют ферменты ДНК-полимера-
зы. У бактерий E. coli синтезируются три типа ДНК-полимераз (I, II и
III). Главную роль в репликации хромосомной ДНК у бактерий E. coli
играет ДНК-полимераза III.

Доказано, что синтез ДНК протекает только в направлении от 5′ к
3′-ОН концу (рис. 25). Однако цепи ДНК противоположно направлены и
поэтому синтез одной из дочерних цепей осуществляется непрерывно с
помощью ДНК-полимеразы III в направлении 5′ → 3′. ДНК-полимераза
III перемещается по цепи 3′ → 5′ в направлении раскрывания репли-
кативной вилки и синтезирует новую цепь. Эта цепь называется веду-
щей, или лидирующей.

Копия второй цепи (5′ → 3′) называется запаздывающей и она синте-
зируется из фрагментов ДНК размером 1000–2000 нуклеотидов, которые
называются фрагментами Оказаки. Для синтеза фрагментов Оказаки
необходима «затравка», или праймер. В качестве затравки выступает ко-
роткая цепь РНК, которая синтезируется с помощью ДНК-зависимой
РНК-полимеразы на матрице ДНК. К этой затравке ДНК-по-лимераза III
присоединяет дезоксирибонуклеотиды, в результате образуются фраг-
менты Оказаки. РНК-праймеры удаляются за счет активности ДНК-по-
лимеразы I, после чего игаза сшивает отдельные фрагменты Оказаки друг с другом и целостность новой цепи восстанавливается.

 ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЙ БИЛЕТ 10 

F-плазмиды, функция

Плазмиды — кольцевидные молекулы ДНК, способные к саморепликации. Их возможные состояния:

F-плазмида (половой фактор или фактор фертильности) - способность к переносу плазмидных и хромосомных генов при конъюгации бактерий через половые ворсинки. F-плазмида, или половой фактор. Контролирует синтез половых ворсинок (sex или F-pili), которые способствуют эффективному спариванию бактерий-доноров с реципиентными клетками при конъюгации. F-плазмида реплицируется в независимом от хромосомы состоянии и передается при конъюгации в клетки бактерий-реципиентов.

Перенос генетического материала (ДНК) детерминируется tra- опероном F-плазмиды (от англ. transfer — перенос), обеспечивающим конъюгативность. F-плазмиды содержат только tra-оперон, в их составе нет никаких других генов.

F-плазмида может встраиваться в бактериальную хромосому и находиться с ней в интегрированном состоянии.