Методы выделения мутантов бактерий

Необходимо согласованно провести ряд последовательных этапов работы:

1. Определить, какой тип мутанта соответствует цели исследования (делеционный, с точковой мутацией, с заменой пар оснований,условно-летальный и т. д.) 2. Выбрать наиболее подходящий мутаген для индукции мутаций, что определяется двумя факторами: типом мутации, которую хотят получить и относительной эффективностью мутагена в отношении желаемой мутации. 3. Создать условия для выражения (экспрессии) новой мутации. Это обусловлено тем, что при практически любых условиях роста бактериальная клетка содержит от полутора до двух копий хромосом. В связи с этим целесообразно дать культуре клеток, обработанной мутагеном, расти в течение определенного времени и тем самым исключить возможность присутствия хромосомы, содержащей мутацию, и исходной. Длительность периода роста зависит как от времени генерации бактерий, так и особенностей роста. 4. Провести обогащение по желаемому мутанту для повышения вероятности его выделения. Обычно возникновение мутаций – относительно редкое событие. Особенно трудно выделить мутантные клетки, если применяются непрямые методы селекции. В самой распространенной методике обогащения используется антибиотик пенициллин. При выращивании культуры, содержащей как мутировавшие, так и немутантные клетки в синтетической среде, не обеспечивающей рост мутантов, пенициллин вызывает избирательную гибель только активно делящихся клеток, нарушая у них процесс синтеза клеточной стенки. В оптимальных условиях можно достичь 1000-кратного обогащения мутантами по отношению к немутантам.5. Обнаружить новый мутант соответствующими прямыми или непрямыми методами отбора: прямым или непрямым.6. Изучить свойства мутанта, картировать локус новой мутации, т.е определить ее локализацию на бактериальной хромосоме.

3. Система рестрикции и модификации бактериальной клетки

Система Р-М – ферментативная система бактерий, разрушающая попавшую в клетку чужеродную ДНК. Основная её функция – защита клетки от чужеродного генетического материала, например, бактериофагов и плазмид. Для компонентов системы характерны два типа активности – метилтрансферазная(метилазная) и эндонуклеазная. Система Р-М специфична по отношению к определенным последовательностям нуклеотидов в ДНК, называемых сайтами рестрикции. Если нуклеотиды в сайте рестрикции не метилированы, эндонуклеаза рестрикции вносит в ДНК двуцепочечный разрыв(часто-со смещением на несколько нуклеотидов между цепями), при этом биологическая роль молекулы ДНК нарушается. Если ДНК в месте действия ферментов рестрикции метилирована, её расщепления не происходит. Подобная специфичность система Р-М позволяет бактериям проводить селективное расщепление чужеродной ДНК, не затрагивая собственную.Функционирование системы можно рассмотреть на бактериофаге λ и клеток штамма E. coli K-12. Развитие фага приводит к эффективности посева равной единице: каждая частица бактериофага заражает бактериальную клетку, репродуцируется в ней и дает потомство, фиксируемое визуально по наличию на газоне чувствительных бактерий зон лизиса или бляшек. Если фаголизатом, полученным после цикла развития фага λ на бактериях штамма E. coli K-12, инфицировать бактерии E. coli штамма C, то эффективность посева будет значительно ниже (10-4–10-5). Следовательно, не каждая фаговая частица по каким-то причинам способна размножаться в клетках нового хозяина. Если же фаговые частицы, образовавшиеся после цикла репродукции на клетках E. coli C, использовать для заражения такой же культуры (E. coli C), то размножение бактериофага λ, вновь будет проходить нормально и эффективность посева составит единицу. Однако, если перед заражением штамма E. coli C фаг пропассировать на штамме E. coli K-12, то на штамме E. coli C он будет развиваться с низкой эффективностью.Таким образом, при смене хозяина наблюдается значительное ограничение размножения фага λ, которое получило название рестрикции. Рестрикция обусловлена расщеплением инфицирующей ДНК фага под действием фермента, специфичного для штамма-хозяина. Ферменты эти получили название рестриктаз. Благодаря своему нуклеазному действию они препятствуют поддержанию чужеродной ДНК в бактериальной клетке. С другой стороны, если фаг проделал полный цикл репродукции в новом хозяине, то в дальнейшем в этом же хозяине, он не подвергается ограничению, или рестрикции.