Экзаменационный билет 17

 

 

1. Трансформация, характеристика этапов трансформации

 

Трансформация – разновидность рекомбинативной изменчивости микроорганизмов, сопровождающаяся переносом ДНК от донора к реципиенту через окружающую среду. В процессе трансформации ДНКфрагмент погибшей и разрушенной бактерии встраивается в ДНК реципиента, находящегося в состоянии компетенции.

Трансформировать клетки можно также и плазмидной ДНК. Для осуществления трансформации необходимы следующие условия:

l Наличие небольшого (до 20 генов) фрагмента двухцепочечной ДНК донорской клетки. Одноцепочечные или меньшего размера ДНК быстро разрушается нуклеазами окружающей среды.

2 Наличие реципиента, находящегося в состоянии компетенции. Компетентностью при генетической трансформации обычно называется способность бактериальных клеток адсорбировать и поглощать чужеродную ДНК.

Стадии трансформации:

1 Адсорбция донорной ДНК на поверхности реципиентной клетки. На этом этапе ДНК чувствителен к ДНКазе.

2 Поглощение донорной ДНК реципиентной клеткой. Причем ДНК может поглощаться только теми клетками, которые находятся в состоянии компетентности. На этой стадии ДНК уже нечувствительна к действию ДНКазы.

3 Образование в реципиентной клетке однонитевых фрагментов донорной ДНК.

4 Синапсис одноцепочечной донорной ДНК с двухцепочечной хромосомой реципиента.

5 Интеграция части донорной молекулы ДНК в реципиентную ДНК в результате гомологичной рекомбинации. Рекомбинация требует сходства между генетической информации донора и реципиента и наличия генов бактериальной рекомбинации – recA, B и C. В редких случаях возможна рекомбинация между отдаленными видами.

6 Репликация рекомбинантной молекулы ДНК. 22

7 Экспрессия генов, переданных от донора, т. е. образование рекомбинантов, называемых трансформантами. Количество переносимой при трансформации ДНК составляет около 10 т. п. н.

 

2. Особенности строения ДНК бактерий

Генетический материал прокариот представлен молекулой (молекулами) ДНК, уложенной в компактную структуру и локализованной в ограниченных участках цитоплазмы, не имеющей, в отличие от эукариот, собственной ядерной мембраны. Учитывая эти особенности, генетический аппарат прокариот принято называть нуклеоидом.

ДНК в хромосоме суперспирализована; ее размер в раскрученном состоянии может достигать 1 мм. ДНК состоит из двух комплементарных друг другу цепочек: напротив аденина одной цепочки в другой находится тимин, напротив гуанина – цитозин. Цепи антипараллельны и располагаются во взаимно противоположных направлениях: одна в ориентации 5' → 3', другая – 3'→ 5'. На 5' конце ДНК находится фосфатная группа, прикрепленная к 5-ому углеродному атому дезоксирибозы. 3' конец оканчивается ОН-группой, присоединяющейся к 3-ему углеродному атому дезоксирибозы. В геноме разных видов бактерий содержание нуклеотидов варьирует от 5, 8х105 до 13 х 106 п.н., что соответствует приблизительно 103 генов (1 ген на 1000 п.н.). Это в 100 раз больше, чем у вирусов, и в 1000 раз меньше, чем в среднем у эукариот.

В составе первичной структуры ДНК микроорганизмов могут находиться следующие компоненты:

 1 Простые повторяющиеся последовательности (SSR) – состоят из 2–6 нуклеотидов, которые могут много раз в тандеме повторяться, например, ЦAT ЦAT ЦAT.

2 CpG мотивы. Богатые гуанином и цитозином последовательности нуклеотидов. Чаще встречаются в начале гена. Распознаются Toll-like рецепторами клеток иммунной системы.

Мобильные генетические элементы (мигрирующие, прыгающие гены) – участки ДНК, способные к транспозиции, или случайному перемещению, из одного места в другое: в пределах одной молекулы ДНК, из одной ДНК в другую. Не способны к самостоятельной репликации. Размножаются в составе бактериальной хромосомы или плазмид. К подвижным генетическим элементам относятся: ISэлементы, транспозоны, интегроны.

 

3. Плазмиды бактерий и их функции

Плазмиды - это линейные или кольцевые ковалентно замкнутые молекулы ДНК, содержащие от 1500 до 90000 пар нуклеотидов.

Их возможные состояния:

автономное (в цитоплазме);

интегрированное (в нуклеоиде).

Большинство плазмид состоит из трех групп генов: участка ДНК, ответственного за автономную репликацию плазмиды в клетке; системы генов, обеспечивающих возможность переноса плазмид из одной клетки в другую; генов, определяющих свойства, полезные для клетки-хозяина.

Итак, плазмиды содержат: 1) точку ori (есть у всех репликонов; это последовательность нуклеотидов, с которой начинается репликация); 2) ген, кодирующий Repбелок, участвующий в инициации репликации плазмиды; 3) гены, кодирующие ре гуляторные белки репликации.

Плазмиды подразделяются на различные категории в зависимости от свойств, которые они кодируют у бактерий:

Категории плазмид	Кодируемое свойство
F-плазмида (половой фактор или фактор фертильности)	Способность к переносу плазмидных и хромосомных генов при конъюгации бактерий через половые ворсинки
R-плазмида (фактор множественной лекарственной устойчивости)	Придает бактериям устойчивость к нескольким антибиотикам и другим лекарственным веществам
Плазмиды бактериоциногении	Кодируют синтез бактериоцинов (особых белков), вызывающих гибель близкородственных бактерий. Например, бактериоцины E.coli вызывают гибель патогенных энтеробактерий.
Ent-плазмида	Синтез энтеротоксинов
Hly-плазмида	Синтез гемолизинов
К-88, К-99	Кодируют синтез поверхностных антигенов у бактерий
Биодеградативные плазмиды	Разрушение различных органических и неорганических соединений

 

Функции плазмид:

– регуляторная— компенсирует нарушение функции ДНК нуклеоида (напр., при интеграции плаз­миды в состав поврежденного бактериального генома, неспособного к репликации, его функция восстанавливается за счет плазмидного репликона);

– кодирующая — вносит в бактериальную клетку новую информацию:

· индуцирует деление,

· контролирует синтез факторов патогенности,

· совершенствует защиту бактерий (синтез бактериоцинов, резистентность к антибиотикам);

 

ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЙ БИЛЕТ 18 

 

1. Бактериоцины, классификация, механизм действия

Плазмиды бактериоциногенности детерминируют синтез бактериоцинов (колицинов, стафилоцинов, вибриоцинов, пестицинов) — белковых антибиотикоподобных веществ, обладающих бактерицидным действием в отношении близкородственных видов микроорганизмов. Они редко интегрируют в нуклеоид.

Механизмы бактерицидного действия бактериоцинов:

– нарушение функции рибосом;

– ферментативное разрушение ДНК (являются нуклеазами);

– нарушение функции ЦПМ.

Бактериоцины различаются не только по спектру действия, но и по физикохимическим, морфологическим и некоторым другим свойствам. Согласно наиболее принятой классификации Д. Бредли (1967), бактериоцины делят на три группы:

 1) бактериоцины с низкой молекулярной массой, которые не осаждаются при ультрацентрифугировании, чувствительны к протеолитическому ферменту трипсину, термостабильны и неразличимы в электронном микроскопе;

2) бактериоцины с высокой молекулярной массой, которые легко осаждаются при ультрацентрифугировании, резистентны к ферменту трипсину, термолабильны, выявляются в электронном микроскопе как фагоподобные структуры или их компоненты;

3) бактериоцины, для которых четко показана ферментативная активность.

По механизму действия на бактериальную клетку бактериоцины подразделяют на четыре основные группы:• ингибирующие окислительное фосфорилирование в цитоплазматической мембране;

• разрушающие ДНК;

• блокирующие синтез белков;

• нарушающие полупроницаемость цитоплазматической мембраны.

 

2. Основные этапы взаимодействия фагов и бактерий

Бактериофаги — вирусы бактерий, обладающие способностью специфически про­никать в бактериальные клетки, репродуцироваться в них и вы­зывать их растворение (лизис).

Стадии взаимодействия фага с клеткой:

адсорбция

проникновение (впрыскивание НК внутрь клетки)

репродукция

самосборка (морфогенез)

выход бактериофага из клетки (путем взрыва)

Вирулентный бактериофаг – поражает клетку, размножается в ней и лизирует ее.

По механизму взаимодействия различают вирулентные и умеренные фаги.

Вирулентный бактериофаг – поражает клетку, размножается в ней и лизирует ее.

Умеренный б/ф – проникает в клетку, не размножается, не лизирует, сохраняется в виде плазмиды или встраивается в геном.

Профаг – умеренный б/ф, встроенный в геном бактерии.

Лизогенная культура – культура микробов, несущая в своем геноме профаг.

Лизогения – биологическое явление симбиозамикровной клетки с профагом.

Лизогенные культуры невосприимчивы к повторному заражению гомологичным или близкородственным фагом и приобретают дополнительные свойства, которые находятся под контролем генов профага. Изменение свойств мик­роорганизмов под влиянием профага получило название фаго­вой конверсии. Умеренные фаги являются мощным фак­тором изменчивости микроорганизмов.

 

 

3. Ферменты бактерий

Ферменты – это биологические катализаторы (повышают скорость химических реакций). По химической природе они являются белками.

Как и ферменты других организмов, бактериальные ферменты делят на 6 классов в соответствии с типом катализируемых реакций:

- 1 класс – оксидоредуктазы – катализируют окислительно-восстановительные реакции;

- 2 класс – трансферазы – катализируют реакции переноса различных групп от одних соединений к другим;

- 3 класс – гидролазы – катализируют реакции расщепления веществ на более простые соединения с участием воды;

- 4 класс – лиазы – катализируют реакции отщепления (или присоединения) от субстратов различных химических групп негидролитическим путем;

- 5 класс – изомеразы – катализируют реакции изомеризации, т.е. превращения органических веществ в их изомеры;

- 6 класс – лигазы – катализируют реакции синтеза сложных соединений из более простых соединений.

Ферменты бактерий делят на экзо- и эндоферменты.

Эндоферменты катализируют процессы внутриклетки. Экзоферменты выделяются бактериями в окружающую среду. Это ферменты:

а) пищеварительные ферменты, которые расщепляют сложные питательные вещества до простых веществ;

б) защитные ферменты, например, пенициллиназа защищает клеточную стенку от действия антибиотика пенициллина;

в) ферменты агрессии – факторы вирулентности патогенных бактерий;

- гиалуронидаза – расщепляет гиалуроновую кислоту;

- дезоксирибонуклеаза – расщепляет ДНК клеток;

- фибринолизин – расщепляет коллаген;

- плазмокоагулаза – свертывает плазму крови;

- нейраминидаза – расщепляет нейраминовую кислоту;

- лецитовителлаза – расщепляет лецитин.

 

ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЙ БИЛЕТ 19 

1. Структура оперона бактерий

Оперон — функциональная единица генома у прокариот, в состав которой входят цистроны (гены, единицы транскрипции), кодирующие совместно или последовательно работающие белки и объединенные под одним (или несколькими) промоторами. Такая функциональная организация позволяет эффективнее регулировать транскрипцию этих генов.

Концепцию оперона для прокариот предложили в 1961 году французские ученые Жакоб, Моно, Львов за что получили Нобелевскую премию в 1965 году.

Опероны по количеству цистронов делят на моно-, олиго- и полицистронные, содержащие, соответственно, только один, несколько или много цистронов (генов).

Характерным примером оперонной организации генома прокариот является лактозный оперон, триптофановый, пиримидиновый и bgl опероны у Escherichia coli

Начинается и заканчивается оперон регуляторными областями — промотором в начале и терминатором в конце, кроме этого, каждый отдельный цистрон может иметь в своей структуре собственный промотор и/или терминатор.

К системе регуляции оперона относятся промотор, оператор и ген-регулятор. Промотор расположен перед оператором и является участком, который узнается ферментом РНК-полимеразой, осуществляющим транскрипцию структурных генов. Одна из субъединиц фермента (δ-частица) узнает промотор по специфической последовательности нуклеотидов (блок Прибнова), благодаря чему РНК-полимераза связывается с матрицей.

 

2. Виды мутагенов, механизм их действия

Мутагенами могут быть химические агенты (нитрит, алкилируюшие агенты, акридиновые красители, этиленимин, азотистый или серный иприт и т.д.), физические (ультрафиолетовые лучи – 260 нм, ионизирующее излучение) или биологические (бактериофаги, транспозоны и т.д.). Под действием мутагена частота мутаций увеличивается и составляет 10-5–10-3 (одна мутация появляется при репликации 1000–100 000 генов).

Азотистая кислота (HNO2) дезаминирует (отщепляет аминогруппу и замещает другой группой) аденин, гуанин или цитозин, что приводит к ошибкам при репликации ДНК. В частности, в результате замещения аминогруппы гидроксильной группой аденин превращается в гипоксантин, который структурно сходен с гуанином. При репликации ДНК гипоксантин спаривается с цитозином вместо тимина, что приводит к мутации АТ–ЦГ

Алкилирующие агенты – нитрозогуанидин, нитрозометилмочевина, этилэтансульфонат, этилметансульфонат, сернистый иприт и другие – принадлежат к наиболее эффективным мутагенам. Они модифицируют (алкилируют) в области репликативной вилки преимущественно пуриновые основания, в первую очередь гуанин, вызывая его спаривание с тимином вместо цитозина. В результате этого возникают главным образом транзиции типа ГЦ–АT.

Молекулы акридиновых красителей (акридиновый оранжевый, акрифлавин, трипофлавин) внедряются между соседними азотистыми основаниями в цепи ДНК и увеличивают расстояние между ними. Такое пространственное изменение при репликации ДНК может вызывать ошибки двух типов – утрату нуклеотида или включение дополнительной пары нуклеотидов.

УФ-лучи действуют на тиминовые основания, следствием чего является образование димеров тимина в ДНК. Такие димеры служат источником возникновения ошибок при репликации ДНК. УФ-лучи вызывают мутации типа транзиций, трансверсий или делеций.

Как мутагенные факторы биологической природы рассматривают перемещающиеся (мобильные, мигрирующие) генетические элементы бактерий – дискретные сегменты ДНК, способные к самостоятельному перемещению из одного участка в другой в пределах репликона, а также к перемещению из одного репликона (хромосомного, плазмидного или фагового) в другой. К таким элементам относятся простые вставочные последовательности (IS-элементы), транспозоны (Tn-элементы) и фаги178 транспозоны (Mu, Д3112 и др.). Интеграция их в репликоны осуществляется независимо от системы общей рекомбинации клеток, которая требует гомологии у рекомбинирующих структур.

 

 

3. Инсерционные элементы, структура, функция

Инсерционные последовательности, или IS-элементы. Это разновидность мобильных генетических элементов, которые не несут в своем составе структурные гены, а только гены, отвечающие за перемещение. Многообразие IS-элементов обозначают цифровыми индексами – IS1, IS 6010. Их размер меньше, чем транспозонов, и составляет от 700 до 1800 п.н., но описаны IS- элементы более крупных и мелких размеров – 5700 п.н. и 200 п.н.

Центральную часть ISэлемента занимает ген, кодирующий траспозазу; некоторые ISэлементы несут промоторы или репрессоры генов, или их части. На обоих концах IS-элемента находятся повторяющиеся последовательности, или палиндромы, размером 10–40 п.н., по которым транспозаза распознает его и вырезает.

Транспозиция происходит двумя путями:

1) консервативным: покидая один участок IS-элемент встраивается в другой;

2) репликативным: синтезируется копия, которая встраивается в другой участок генома. Встраивание, как правило, осуществляется в участках богатых А/Т.

Значение IS-элементов:

1 Участвуют в мутационной изменчивости микроорганизмов – инсерциях и делециях. Инсерция IS-элементов в бактериальную ДНК приводит к синтезу неполноценного белка.

2 Являются генетическими маркерами вида или рода бактерий. Некоторые IS последовательности специфичны для определенных видов микроорганизмов, что позволяет их использовать для видовой идентификации бактерий.

3 Являются местом распознавания и встраивания плазмид и генноинженерных векторов. Плазмиды и генно-инженернын векторы встраиваются в бактериальную хромосому в области IS последовательностей.

4 Участвуют в регуляции функций генов – активации или репрессии, так как несут в

 

 

Билет20

Виды репарации ДНК

У бактерий имеются по крайней мере 3 ферментные системы, ведущие репарацию — прямая, эксцизионная и пострепликативная.

Прямая репарация — наиболее простой путь устранения повреждений в ДНК, в котором обычно задействованы специфические ферменты, способные быстро (как правило, в одну стадию) устранять соответствующее повреждение, восстанавливая исходную структуру нуклеотидов.

Примером этого процесса является фотореактивация. Наиболее распространённым химическими изменениями, вызванных ультрафиолетовым облучением, являются образование циклобутан-пиримидиновых димеров (CPD) и пиримидин-пиримидиновых фотопродуктов (6-4PP-тиминовых димеров), когда два соседних пиримидиновых оснований ковалентно связываются друг с другом. Для удаления индуцированных ультрафиолетом повреждений ДНК у многих микроорганизмов применяются ферменты — ДНК-фотолиазы, специфично связывающиеся с CPD (CPD-фотолиаза) или с 6-4PP (6-4PP-фотолиазы) и исправляющие эти повреждения. Эти ферменты и активируются под действием видимого света.

Эксцизионная репарация включает удаление повреждённых азотистых оснований из ДНК и последующее восстановление нормальной структуры молекулы по комплементарной цепи. Ферментативная система удаляет короткую однонитевую последовательность двунитевой ДНК, содержащей ошибочно спаренные или поврежденные основания, и замещает их путём синтеза последовательности, комплементарной оставшейся нити.

Эксцизионная репарация базируется на распознавании модифицированного основания различными гликозилазами, расщепляющими N-гликозидную связь этого основания с сахарофосфатным остовом молекулы ДНК. При этом существуют гликозилазы, специфически распознающие присутствие в ДНК определенных модифицированных оснований.

Другой тип эксцизионной репарации — эксцизионная репарация нуклеотидов, предназначенная для более крупных повреждений, таких как образование пиримидиновых димеров. У прокариот эксцизионная репарация нуклеотидов осуществляется системой белков Uvr. Три из этих белков — UvrA, UvrB и UvrC — образуют эндонуклеазу, известную как UvrABC-эндонуклеаза.

Пострепликативная репарация - тип репарации, имеющей место в тех случаях, когда процесс эксцизионной репарации недостаточен для полного исправления повреждения: после репликации с образованием ДНК, содержащей повреждённые участки, образуются одноцепочечные бреши, заполняемые в процессе гомологичной рекомбинации при помощи белка RecA. Это единственный тип репарации, не имеющий этапа узнавания повреждения.