Методы гистохимического анализа

Лекция – 3.

11.02.2019 г.

Тема: «Конкретно-научные методы научных исследований»

Вопросы.

Методы гистохимического анализа.

Методы определения морфометрических параметров хвои.

Методы определения пигментного состава хвои.

Методы определения водоудерживающей способности листового аппарата.

Методы определения морфологических характеристик шишек и семян, показателей выхода семян из шишек.

 

 

Ключевые слова: предметно-научные методы, специальные методы, гистохимический анализ, морфометрический анализ, пигментный состав, водоудерживающая способность, крахмал, жиры, моносахариды, дисахариды, водорастворимые сахара, ксилема, лигнификация, листовая пластинка, хвоя, линейные параметры масса, хлорофилл, каротиноиды, шишки, плоды, семена, выход семян.

 

Бюджет времени: 2 часа.

В том числе по рассматриваемым вопросам:

1. Методы гистохимического анализа – 0,5 часа.

2. Методы определения морфометрических параметров хвои – 0,25 часа.

3. Методы определения пигментного состава хвои – 0,25 часа.

4. Методы определения водоудерживающей способности листового аппарата – 0,5 часа.

5. Методы определения морфологических характеристик шишек и семян, показателей выхода семян из шишек – 0,5 часа.

 

 

Литература.

1. Моисейченко В.Ф. Заверюха А.Х, Трифонова М.Ф. Основы научных исследований в плодоводстве, овощеводстве и виноградарстве. – М.: Колос, 1994. – 383 с.

2. Быков В.В. Методы науки. – М.: Наука, 1974.

3. Коптев В.В., Богомягких В.А., Трифонова М.Ф. Основы научных исследований и патентоведения. М.: Колос, 1993.

4. Трифонова М.Ф., Заика П.М., Устюжанин А.П. Основы научных исследований. М.: Колос, 1993. – 239 с.

5. Моисейченко В.Ф., Трифонова М.В. Основы научных исследований в агрономии. – М.: Колос, 1996.

6. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта. М.: Колос, 1985. – 416 с.

7. Никитин К.Е., Швиденко А.З. Методы и техника обработки лесоводственной информации. – М.: Лесная промышленность, 1978. – 272 с.

8. Инструкция по проведению лесоустройства в лесном фонде России. Ч. 1. Организация лесоустройства. Полевые работы. //Федеральная служба лесного хозяйства России/ Согласовано с Минприроды России 23 декабря 1994 г.; Утверждено приказом Рослесхоза от 15 декабря 1994 г. № 265. М.: ВНИИЦлесресурс, 1995. – 175 с.

9. Василенко П.М., Погорелый Л.В. Основы научных исследований. – Киев: Высшая школа, 1958. ***** с.

10. Иванов В.В., Гноевой Н.В., Монастырская Г.В. Анализ, оценка и стимулирование эффективности научного потенциала. – Киев: Наукова думка, 1990. ***** с.

11. Мальцев П.М., Емельянова Н.А. Основы научных исследований. Киев: Высшая школа, 1982.

12. Молчанов А. А. Методика определения прироста древесных растений - М.: Наука, 1967. - 27 с.

 

 

Асинхронно-синхронная связь:

1. Бессчетно Владимир Петрович: E-mail: lesfak@bk.ru.

Мобильный телефон: 8-906-355-81-97.

2. Бессчетнова Наталья Николаевна: E-mail: besschetnova1966@mail.ru.

Мобильный телефон: 8-960-160-54-32.

 

Методы гистохимического анализа

 

Привлечение гистохимических исследований как методов выявления разнокачественности растений принято достаточно широко (Сабинин, 1963; Генкель, 1964; Гродзинский, 1964; Барская, 1967; Ахматов, 1968). Признаки физиологического состояния растений (морозостойкость, сроки выхода из состояния покоя, скорость роста, сроки макро- и микроспорогенеза и др.), обусловливают приспособленность организма к среде и его выживаемость (Сергеев, 1953; Уильямс, 1968; Холоденко, 1970; Лир, 1974; Либберт, 1976; Крамер, 1983; Карасев, 1997, 1998 а, б, в; 2000; 2001; Демаков, 2000; 2002 а, б; Карасева, 2003; Mencuccini, 2010; 2013).

 

Камеральный этап работы выполняется в лаборатории лесной селекции и генетики кафедры лесных культур НГСХА. Первичная единица выборки в гистохимическом опыте представлена временными препаратами поперечных срезов из средней части годичного прироста, которые после окрашивания и фиксации анализировались с помощью микроскопа Микмед-2. Кроме того они фотографировались с помощью микрофотонасадки, адаптированной к цифровой фотокамере «OLIMPUS», соединенной с телеэкраном. Наличие в клетках сахаров, крахмала и жиров оценивалось дифференцировано по учетным зонам каждой из тканей, привлеченных для анализа содержания этих веществ в соответствии с существующими разработками (Бессчетнова, 1975; Бессчетнов, 1994). Нами выделены следующие учетные зоны (рис. 3.1):

Рисунок 3.1 – Учетные зоны на поперечном срезе годичного побега

сосны обыкновенной (фото Н.Н. Бесчетновой)

 

-   сердцевина;

-   перимедуллярная зона ксилемы;

-   сердцевинные лучи;

-   ранняя ксилема;

-   поздняя ксилема;

-   смоляные ходы ранней ксилемы;

-   смоляные ходы поздней ксилемы;

-   смоляные ходы флоэмы;

-   прикамбиальная зона флоэмы;

-   прифеллогенная зона флоэмы;

-   средняя зона флоэмы;

-   корковая зона (зона паренхимных клеток, лежащая на периферии побега между феллогеном и внешней границей побега).

 

Оценка дается по следующим категориям учетов:

-   по каждой учетной зоне тканей отдельно;

-   в сумме баллов по всем учетным зонам;

-   в средних значениях бальных оценок для учетной зоны.

 

По каждому плюсовому дереву (ортету) и его клонам (раметам) вычисляют средние значения. В качестве контроля визирования мы рекомендуем использовать неокрашенные срезы, не подвергавшиеся воздействию тестирующих реагентов (Бессчетнова, 2010 а; 2011 а). С ними сравнивают срезы, обработанные соответствующими реактивами. Окраска их клеток в ксилеме соответствует отсутствию лигнификации и запасных веществ. При проведении гистохимического анализа нами использовался собственный опыт выполнения таких работ (Бессчетнов, 2013 а; 2014 а; Бессченова, 2003 г; 2003 з; 2004 з; 2005 б, в; 2008 в; 2010 а; 2011 з; 2012 в, г;2013 а; 2014 д).

 

Наличие крахмала в тканях побегов связывают с устойчивостью растений к неблагоприятным зимним условиям. Исследования в данном направлении проводятся достаточно активно (Ericsson, 1983; Brahim, 1996; Ludlow, 1997; Kakei, 1999; Schaberg, 2000; Andersone, 2002; Bergström, 2003; Pardos, 2003; Jiménez, 2009; Mencuccini, 2010; Rodríguez-Calcerrada, 2010; Woodruff, 2011). Крахмал выявляли цветной реакцией на раствор Люголя (Прозина 1960; Гродзинский, 1964). Оценка его содержания давалась в условных балах по предложенной нами (Бессчетнова, 2006 а) с учетом существующих разработок (Бессчетнова, 1975; Бессчетнов, 1994) шкале. Мы с вами ранее рассматривали эту шкалу в качестве одного из примеров:

 

0 – крахмал отсутствует полностью: не удается обнаружить ни оного крахмального зерна ни в одной клетке учетной зоны ткани;

1 – крахмал в ограниченном количестве присутствует в единичных (до 10 %) клетках учитываемой ткани;

2 – крахмал присутствует в меньшем числе клеток: окрашенные крахмальные зерна удается зафиксировать примерно в 20 – 30 % клеток;

3 – крахмал фиксируется примерно в половине всех учитываемых клеток ткани (40 – 60 %);

4 – крахмал отмечается в большей части клеток (70 – 90 %);

5 – крахмал в большом количестве присутствует во всех клетках (100 %) учитываемой ткани.

 

Присутствие жиров и жироподобных веществ в тканях растений во многом предопределяет их резистентность к воздействию низких температур, обеспечивает сбалансированность многих процессов жизнедеятельности растительных организмов. Жиры фиксировались реакцией на Судан-III (Прозина, 1960); их содержание также учитывалось в условных балах по предложенной нами (Бессчетнова, 2006 а) шкале, пример которой нами уже рассмотрен в одной из ранее прочитанных лекций:

 

0 – окрашивание отсутствует на всей площади поперечного среза, различий в состоянии окрашенного среза и контрольного среза не обнаруживается;

1 – бледно-розовое окрашивание незначительной части учетной ткани или учетной зоны на поперечном срезе – наблюдается фрагментарное окрашивание поперечного среза (реакция на Судан-III у отдельных тканей или у некоторой их части);

2 – бледно-розовое окрашивание учетной ткани или учетной зоны полностью (вся визируемая поверхность среза приобретает слабо выраженные признаки реакции на Судан-III);

3 – интенсивное красно-оранжевое окрашивание части учетной зоны или учетной ткани (часть учетной зоны имеет интенсивное окрашивание);

4 – полное интенсивное окрашивание учетной зоны или учетной ткани (вся учетная зона имеет полное интенсивное окрашивание);

5 – на фоне интенсивного окрашивания учетной зоны наблюдается присутствие жира в капельножидком состоянии (ярко окрашенные капли жира отчетливо заметны в части или во всех учетных зонах).

 

Параллельно на каждом срезе учитывалось наличие суберина в корковой зоне: Судан-III дает окрашивание в оранжево-красный цвет.

 

Водорастворимые сахара, выступая основным продуктом фотосинтеза, активно участвуют в метаболизме и процессах регенерации древесных растений (Brahim, 1996; Ögren, 1997; Schaberg, 2000; Sevanto, 2003; Mencuccini, 2010; Woodruff, 2011; Husen, 2012). Растворимые сахара (моно - и дисахариды) обнаруживали реакцией Молиша с α-нафтолом (Прозина, 1960; Гродзинский, 1964). Их содержание также оценивалось в условных баллах по шкале, которая также вам уже знакома:

 

0 – окрашивание отсутствует на всей площади поперечного среза, различий в состоянии окрашенного среза и контрольного среза не обнаруживается;

1 – бледно-фиолетовое окрашивание незначительной части учетной ткани или учетной зоны на поперечном срезе – наблюдается фрагментарное окрашивание поперечного среза (реакция на α-нафтол у отдельных тканей или у некоторой их части);

2 – бледно-фиолетовое окрашивание учетной ткани или учетной зоны полностью (вся визируемая поверхность среза приобретает слабо выраженные признаки реакции на α-нафтол);

3 – хорошо выраженное фиолетовое окрашивание части учетной зоны или учетной ткани (часть учетной зоны имеет интенсивное окрашивание);

4 – полное хорошо выраженное фиолетовое окрашивание учетной зоны или учетной ткани (вся учетная зона имеет полное хорошо выраженное окрашивание);

5 –интенсивное темно-фиолетовое окрашивание учетной зоны (ярко окрашенные клетки отчетливо заметны во всех учетных зонах).

 

Состояние и темпы развития ксилемы древесных растений, процессы образования и лигнификации её клеток, соотношение между формируемыми при этом ранней и поздней древесиной, а также их наследственная обусловленность выступают предметом разносторонних исследований, проводимых у нас в стране (Ваганов, 1985; 2000; Бессчетнов, 2014 а; Бабушкина, 2015; Силкин, 2015) и за рубежом(Sundberg, 1994 a,b; Allona, 1998; Plomion, 2001; Uggla, 2001; Cochard, 2004; Hellgren, 2004; Perks, 2005; Gaspar, 2008; Lukjanova, 2008; Mantero, 2008; Fries, 2009; Gapare, 2009; Mast, 2009; Martínez-Vilalta, 2009; Ananías, 2010; Li, 2010; Kılıç, 2010; Gryc, 2011; Begum, 2012; Lloyd, 2012; Mencuccini, 2013; Dubouzet, 2014; Jyske, 2015; Scoffoni, 2015).

 

Одревеснение клетчатки в стенках клеток ксилемы оценивали с помощью качественной реакции лигнина на флороглюцин (Наумов, 1954; Прозина, 1960; Гродзинский, 1964; Барская, 1967). Степень лигинфикации ксилемы устанавливалась по соотношению зон с различной степенью лигнификации клеток. По каждой зоне отдельно велся учет количества рядов клеток в радиальном направлении, начиная от первого ряда в ранней ксилеме и заканчивая последним видимым рядом поздней ксилемы перед камбием, что позволяло выявить долю клеток с полным одревеснением, долю клеток с частичной лигнификацией (полуодревесневших) и долю клеток без лигнификации. Параллельно измерение каждой зоны проводилось окуляр-микрометром. Для формирования количественной оценки степени лигнификации клеток ксилемы в процентах все количество рядов клеток ксилемы (ранней и поздней) принималось за 100%. Количество рядов полуодревесневших клеток распределялось между двумя крайними их категориями (полностью одревесневших и не одревесневших) в равной пропорции. Кроме того, по каждому состоянию лигнификации составлялись структурные уравнения в долях участия каждой категории и в количественном (по количеству клеток в каждом ряду). При этом каждый установленный уровень лигнификации клеток ксилемы мы рекомендуем обозначать буквенным индексом (символом):

 

-   «Л» – полностью одревесневшие (лигнифицированные) клетки;

-   «ПЛ» – полуодревесневшие клетки;

-   «НЛ» – не одревесневшие (не лигнифицированные)клетки.

 

Перед каждым буквенным индексом (символом) ставился числовой коэффициент, обозначающий долю каждой из категорий клеток в их общем количестве или количество рядов каждой категории, с указанием итогового равенства или суммарного количества рядов в итоге. Соотношение зон ранней и поздней ксилемы оценивали количественно по соотношению числа рядов клеток в каждой из них на окончание вегетационного периода, когда все клетки поздней ксилемы претерпели лигнификацию. Оценку следует давать в десятичных дробных числах.

 

В соответствие с вышеизложенным, для построения интегральной оценки текущего состояния ксилемы учитывали следующие показатели, определяющие степень её развитости и уровень лигнификации в наблюдаемом секторе визирования, охватывающем все учетные зоны от сердцевины до камбия:

 

- общее количество рядов клеток ксилемы, сформировавшейся на текущий момент, которое определялось подсчетом всех клеток ксилемы в независимости от факта и степени их лигнификации;

- количество рядов полностью одревесневших клеток ранней ксилемы, которое определялось учетом тех рядов клеток, в стенках которых полностью завершен процесс лигнификации, что подтверждалось их равномерной интенсивной розовой окраской, соответствующей оценке 5 баллов;

- количество рядов абсолютно не одревесневших клеток ксилемы, которое определялось учетом только тех клеток, в стенках которых не фиксируются признаки лигнификации, то есть отсутствует какое-либо окрашивание или оценка 0 баллов;

- количество рядов частично одревесневших клеток ксилемы, которое определялось учетом только тех клеток, процесс лигнификации стенок которых фиксируется, но незавершен полностью, что подтверждалось их равномерной бледно-розовой окраской – окраской разной интенсивности: от 1 до 4 баллов;

- общая глубина одревеснения клеток ксилемы с учетом коэффициента бальной оценки уровня её лигнификации, которая определялась как сумма произведений числа рядов клеток отдельной учетной зоны ксилемы на балл её лигнификации (от 0 до 5 баллов), отнесенных к максимальной балльной оценке (5 баллов), и выражалась в скорректированном на степень лигнификации числе рядов клеток ксилемы;

- абсолютный процент одревеснения клеток ксилемы, который определялся как процентная доля одревесневших в той или иной степени клеток относительно общего числа клеток ксилемы;

- относительный процент одревеснения клеток ксилемы, который определялся как процентная доля полностью одревесневших и скорректированного на степень лигнификации числа рядов клеток ксилемы относительно общего числа клеток ксилемы;

- общая сумма рядов полностью одревесневших клеток ранней и поздней ксилемы.