Методы определения пигментного состава хвои

 

К числу важнейших биологических характеристик древесных видов могут быть отнесены показатели пигментного состава их фотосинтезирующего аппарата (Кундзиньш, 1972; Озолина, 1972; Мезенцева, 1976; Ходасевич, 1982; Воронин, 1995; Тужилкина, 1998 а; 2009; Фомин, 2001; Наквасина, 2008; Бессчетнов, 2014 а). Описана индивидуальная изменчивость пигментного состава хвои у сосны обыкновенной (Мамаев, 1969 б), что обусловлено её происхождением (Правдин, 1972). Выделены светло- и темно-зеленые вариации окраски хвои у сосны обыкновенной (Кириенко, 1972). А.В. Альбенский (1959) поддерживает представление о том, что длина и окраска хвои на побегах прошлого и текущего года – признак хорошего качества древесины и быстрого роста дерева по высоте и диаметру.

 

Защитную роль пигментов признают современные исследователи (Моссэ, 2003; Peguero-Pina, 2008). Наличие пигментов в зимней хвое повышает устойчивость растений (Моссэ, 2003), это явление в центрах происхождения как защита от мутаций отмечено Н.И. Вавиловым (1964). При продвижении с юга на север более устойчивыми являются пигментированные растения (Моссэ, 2003). Н.И. Вавилов (1964) обнаружил преобладание сильно пигментированных форм в центрах формообразования (центры происхождения растений), что он рассматривал как защитную реакцию растений на действие мутагенных факторов.

 

Отмечена связь содержания пигментов в хвое сосны с репродуктивной деятельностью (Оллыкайнен, 1967): непосредственно перед спорогенезом содержание пигментов в хвое резко снижается из-за расхода продуктов их распада на формирование пыльцы. По завершении указанной фенофазы содержание пигментов возрастает, достигая максимума в осенние месяцы. Зимой в хвое преобладают ксантофиллы, прежде всего лютеин, и мало виолоксантина и неоксантина. В летний период перед спорогенезом и после него преобладает каротин. Период, когда в хвое много каротина, составляет 1 – 1,5 месяца (начало июня – середина июля). В остальное время из желтых пигментов преобладает лютеин. Признак сезонной изменчивости окраски хвои имеет наследственный характер и отражает адаптацию к окружающим условиям (Правдин, 1972). Содержание хлорофилла и других пигментов листового аппарата рассматривается в качестве информативных признаков сравнительной оценки и ранней диагностики селекционного материала древесных видов (Барская, 1967; Кундзиньш, 1972; Мезенцева,1976; 1984; Бессчетнова, 2004 д; 2007 а; 2010 а; 2011 а, е, ж; 2013 а; Бессчетнов, 2011 в; Lichtenthaller, 2001; 2009). Среди факторов внешней среды для сосны, как и других растений умеренной зоны, свет остается важнейшим условием фотосинтеза (Linder, 1980), притом, что образование хлорофилла и каротиноидов возможно в темноте (Schoefs, 1998).

 

По мнению ряда авторов (Барская, 1967; Новицкая, 1967; 1971; Петренко, 1970; Озолина, 1972; Ходасевич, 1982; Duysens,, 1961; 1963; Klõšeiko, 2008) содержание пигментов коррелирует с устойчивостью растений к лимитирующим экологическим факторам. Адаптивные реакции хвойных, сосны обыкновенной или ели европейской в том числе, на условия освещенности проявляются в изменении пигментного состава (Bouvier, 1998; Mahoney, 1998; Skuodiene, 2001; Tausz, 2001; Niinemets, 2002 a, b; 2007; Porcar-Castell, 2008). Отмечается их реакция на изменение концентрации углекислого газа в атмосфере, проявляющаяся в изменении содержания хлорофилла-a, хлорофилла-b, их суммарного количества и концентрации каротиноидов (Houpis, 1988; Major, 2007; Kvíčala, 2014). Известна зависимость содержания пигментов хвои, в частности хлорофилла, от температуры почвы и других почвенных характеристик (Rosenthal1, 1997; Kayama, 2002). Сообщается о фотопериодической реакции, которая выражается в изменении содержания пигментов (Rosenthal1, 1997), реакции на содержание озона (Elvira, 1998), на загрязнение (Тужилкина, 1998 б; Kurteva, 1998; Pukacki, 2000; Bačić, 2003; 2004), в том числе «кислотными дождями» (Фукс, 1997), на воздействие ингибиторов (Schoefs, 1998), на симуляцию осенних условий (Busch, 2007). Однако другие исследователи приводят противоположные сведения: не наблюдалось существенных изменений хлорофилла при воздействии ультрафиолетовой радиации на псевдотцугу или Дугласову пихту (Bassman, 2002).

 

Содержание пигментов в хвое находится под сильным генетическим контролем и является в значительной степени наследуемым показателем (Бессчетнова, 2007 а; 2010 а; 2011 а, д; 2011 е, ж; 2013 а), что подтверждается в испытаниях потомств от контролируемых скрещиваний (Major, 2007) и генетическими исследованиями (Lidholm, 1992). Зимне-желтые разновидности из Северной Евразии сохраняют оттенок желтизны независимо от того, высажены они на севере или на юге, выращиваются с внесением удобрений или нет (Райт, 1978). Однако В.М. Ронэ (1972) считает степень генетической детерминации признаков пигментного аппарата невысокой. Это указывает на отсутствие у исследователей единого мнения в вопросах о наследственной специфике пигментного состава листового аппарата деревьев, что в свою очередь служит основанием для продолжения работ в указанном направлении.

 

Сезонная динамика пигментов, участвующих в процессе фотосинтеза, общеизвестна и хорошо изучена, приводится немало сведений по этим вопросам для древесных видов (Оллыкайнен, 1967; Правдин, 1972; Логунов, 2002; Моссэ, 2003). При этом представители одного рода или вида способны значительно различаться динамикой показателя и при одновременном учете могут находиться в разном физиологическом состоянии, на разных этапах своего сезонного развития. Это в определенной мере осложняет реализацию принципа единственного логического различия при их сравнительном анализе. С учетом данных обстоятельств нами для сравнительной оценки плюсовых деревьев сосны обыкновенной был привлечен метод разового сравнения растений, находящихся в одинаковом физиологическом состоянии – состоянии зимнего покоя, который надежно фиксируется у исследуемых объектов. Такой подход к построению схемы опыта обеспечивал наиболее полную сопоставимость получаемых сведений, а также возможность обеспечить адекватное сравнение растений в наиболее критический для их жизнедеятельности период, что особенно важно учитывать при проектировании и создании объектов постоянной лесосеменной базы и единого генетико-селекционного комплекса.

 

Пигментный состав хвои нами изучен у плюсовых деревьев сосны обыкновенной и ели европейской в архивах клонов № 1, № 3, № 4, № 12 и на ЛСП № 1, № 2, № 24 ГБУ НО «Семеновский спецсемлесхоз». Физиологическое состояние растений в момент заготовки образцов – состояние покоя (до выхода из состояния покоя растений). Это позволило сравнивать объекты в период их нахождения в одинаковой фенологической фазе и одинаковом физиологическом статусе.

 

Камеральный этап исследований может быть выполнен в аналитической лаборатории Нижегородской государственной сельскохозяйственной академии в соответствии с общепринятыми методиками определения содержания важнейших пластидных пигментов (Ермаков, 1952; Максимов, 1958; 1978; Шлык, 1971; Маслова, 1986; Lichtentaller, 1983; 2009; Porra, 1989; Wellburn, 1994; Rosenthal1, 1997; Lichtenthaller, 2001; Miazek, 2013). Спектрофотометрический анализ рассматривается как наиболее точный метод количественного определения пигментного состава листового аппарата (Ермаков, 1952; Максимов, 1958; 1978; Шлык, 1971; Lichtenthaller, 1983; Porra, 1989; Wellburn, 1994; Dere, 1998; Gitelson, 1999). Он позволяет установить содержание пигментов по оптической плотности вытяжки без её предварительного разделения. Для этого используют спектрофотометр «Grating 722» (рис. 3.1) или его современные аналоги. С его помощью анализируют вытяжки пигментов из листовой массы в 100 % оптически чистом (ОЧ) ацетоне или вытяжки пигментов в 96 % этаноле.

 

Оценку дают при длинах волн, соответствующих максимумам поглощения: хлорофилла- a (663 нМ), хлорофилла- b (645 нМ), каротиноидов (440 нМ). При этом учитывали, что положение максимума поглощения может смещаться в зависимости от используемого растворителя (Ермаков, 1952; Максимов, 1958; 1978; Шлык, 1971; Третьяков, 1990; Lichtenthaller, 1983; Wellburn, 1994). Концентрации пигментов вычисляли по соответствующим уравнениям Ветштейна и Хольма для 100%-го ацетона и для 96%-го раствора этанола (Максимов, 1978; Третьяков, 1990; Wellburn, 1994).

 

Рисунок 3.1 – Спектрофотометр «Grating 722»

 

Поскольку оптическая плотность раствора в соответствии с законом Бера имеет прямо пропорциональную зависимость от концентрации растворенных в нем веществ, об извлекаемости зеленых пигментов растворами разной степени полярности можно судить по графикам. Для сравниваемых растений строят спектры поглощения в координатах логарифмической шкалы поглотительной способности, при этом по вертикальной оси откладывают отрицательные по знаку величины логарифма процента пропускания света конкретной длины волны испытываемым раствором.

 

Первичная единица выборки в данном опыте представлена экстракционной навеской, состоящей из объединенной хвои, собранной пропорционально со всех установленных участков кроны одного учетного растения – рамета одного плюсового дерева. Каждая рамета представлена одной навеской хвои. Приготовление экстракционной навески происходило в несколько этапов.

 

Вначале производят нарезку хвои с заготовленных побегов в фарфоровые ступки или чашки Петри (рис. 3.2). Затем производят взвешивание нарезанной хвои на аналитических весах с точностью до 0,001 г (рис. 3.3).

 

Рисунок 3.2 – Нарезка хвои в фарфоровые ступки

 

 

Рисунок 3.3 – Взвешивание отобранной хвои на аналитических весах

 

 

Далее осуществляют предварительное механическое измельчение хвои до однородной массы (рис. 3.4). Его выполняют вручную в лабораторных ступках с добавлением крошки стекла (примерно 1 г на ступку) и карбоната кальция CaCO₃ для нейтрализации клеточного сока.

 

Рисунок 3.4 – Приготовление экстракционной навески

 

Содержимое ступки растирают и перемешивают до образования однородной массы ярко-зеленого цвета (см. рис. 3.4), после чего смыв переносят в мерную колбу объемом 25 мл, а ступку тщательно промывали и ополаскивали этанолом. Для предотвращения разрушения хлорофилла растирание производилось в темном помещении, а полученный экстракт хвои отстаивался в шкафу без доступа света, после чего помещался в лабораторную центрифугу для отделения собственно пигментной вытяжки.

 

В наших исследованиях в качестве экстрагирующего вещества был взят 96 % раствор этилового спирта (вода в растворителе необходима для гидролиза связей пигментов с белком). Данное решение обосновано тем, что основные пигменты, находящиеся в пластидах, очень хорошо растворяются и выделяются из пигментно-липопротеидного комплекса именно данным веществом. Каротиноиды, являясь в основном липофильными соединениями, хорошо растворяются в растворяющих липиды соединениях (спирт, ацетон, бензин и др.). Однако ввиду того, что пигменты связаны с липопротеидами, их полное извлечение возможно лишь при использовании полярных (спирты, ацетон) растворителей. Известно, что полярные растворители вызывают денатурацию белка и, нарушая связи пигментов с липидопротеидным комплексом, обеспечивают быструю экстракцию всех пигментов, что нельзя сказать о чистых неполярных растворителях. Нами был принят во внимание тот факт, что при убывающей полярности растворителя обнаруживается специфическая зависимость количества хлорофилла, перешедшего в растворитель, от полярности растворителя, свидетельствующая о наличии в зеленой ткани хвои как минимум двух форм хлорофилла.

 

Для пересчета содержания анализируемых пигментов листового аппарата на единицу сухого вещества определяли его наличие в каждой навеске хвои после высушивания до абсолютно сухого состояния в лабораторных сушильных шкафах HS 61 A (рис. 3.5).

 

Рисунок 3.5 – Сушильные шкафы HS 61 A для определения абсолютно сухой

массы экстракционной навески листового аппарата

 

Анализируемыми показателями пигментного состава хвои выступают: содержание хлорофилла- a, хлорофилла- b, их суммарное количество и концентрация каротиноидов, а также отношение содержания хлорофилла- a, к содержанию хлорофилла- b; отношение различных форм и суммарного содержания хлорофилла к содержанию каротиноидов, их доля в пигментном составе (Бессчетнова, 2007 а; 2010 б; 2011 д, е, ж; 2013 в; Бессчетнов, 2014 б). Целесообразность такого подхода к подобным исследованиям признана достаточно широко (Lichtentaller, 1987; 2009; Houpis, 1988; Rosenthal1, 1997).

 

Анализируемыми показателями пигментного состава хвои выступали: содержание хлорофилла- a, хлорофилла- b, их суммарное количество и концентрация каротиноидов, а также отношение содержания хлорофилла- a, к содержанию хлорофилла- b; отношение различных форм и суммарного содержания хлорофилла к содержанию каротиноидов, их доля в пигментном составе (Бессчетнова, 2007 а; 2010 а; 2011 д, е, ж). Целесообразность такого подхода к подобным исследованиям признана достаточно широко (Lichtentaller, 1987; 2009; Houpis, 1988; Rosenthal1, 1997).