2020-10-10
190
Чашки Петри, колбы на 250 мл, фильтровальная бумага, ножницы, скальпель, спиртовка, пинцет, предметные стекла, микробиологическая петля, стеклянная палочка с оттянутым концом, часовое стекло, пробирка со стерильной дистиллированной водой, колба с жидкой средой Гетчинсона, колба с агаризованной средой Гетчинсона, среда Имшенецкого, исследуемая почва, навоз, водные растворы фуксина и генцианвиолета, микроскоп.
Ход работы
Выделение анаэробных клетчаткоразрушающих бактерий. Для получения накопительной культуры анаэробных клетчаткоразрушающих бактерий используют питательную среду Имшенецкого. Состав среды (г/л дистиллированной воды):
NaNН4НР04—1,0
КН2РО4 —0,5
К2НРО4—0,5
МgSO4—0,4
NaСl—0,1
МnSO4.—1 капля 1%-ного раствора
FеSO4—1 капля 1%-ного раствора
Пептон—5,0
СаСО3—2,0
фильтровальная бумага—15,0
рН среды—7,0—7,4
Питательную среду разливают высоким слоем в большие пробирки и в каждую пробирку нарезают 2—3 полоски фильтровальной бумаги длиной 6—8 см, шириной 0,5 см. Пробирки с питательной средой стерилизуют в автоклаве при давлении 1 атм 20 мин. Пробирки заражают комочком почвы или навоза. Часть пробирок помещают в термостат при температуре 30—35°С для выделения мезофильных форм, остальные пробирки выдерживают в термостате при 60—65°С для накопления термофильных клетчаткоразрушающих бактерий.
|
|
|
При 60°С через 3—4 суток в пробирках бурно начинается процесс разрушения клетчатки, жидкость пенится, выделяются газы. Полоски фильтровальной бумаги желтеют, ослизняются, постепенно превращаясь в аморфную массу, и оседают на дно. Брожение заканчивается на 8—10-е сутки. При температуре 30—35 °С клетчатка разрушается медленнее и заканчивается через 2—3 недели.
|
|
Рис. 30. Анаэробные клетчаткоразрушающие бактерии.Clostridium omelianskii. Среда Имшенецкого. Карболовый фуксинРазрушенные массы клетчатки подвергают микроскопическому анализу. Микробиологической петлей разрушенную клетчатку переносят на предметное стекло в каплю жидкости из пробирки и делают мазок.
Мазок окрашивают фуксином или генцианвиолетом и микроскопируют, пользуясь объективом МИ-90.
В поле зрения микроскопа видны длинные палочки, спорулирующие клетки типичной плектридиальной формы и свободнолежащие споры(рис. 30).
рулирующие клетки типичной плектридиальной формы и сво-боднолежащие споры (рис. 30).
Выделение аэробных клетчаткоразрушающих бактерий. Для выделения аэробных клетчаткоразрушающих бактерий используют питательную среду Гетчинсона. Состав среды (г/л дистиллированной воды):
К2НРО4 —1,0
СаС12 —0,1
МgSО4 —0,3
|
|
|
NaCl —0,1
FeCl3 —0,01
NaNO3 —2,5
рН среды —7,2-7,3
Питательную среду стерилизуют 20 мин в автоклаве при 1 атм. Параллельно из фильтровальной бумаги готовят складчатые фильтры и стерилизуют их в термостате или автоклаве.
Питательную среду разливают в конические колбы слоем 1,5—2,0 см, среду заражают комочком почвы и на поверхность среды опускают складчатый фильтр конусом вверх. Колбы закрывают ватными пробками и помещают в термостат при температуре 25—30°С на 10—14 суток. На границе питательной среды и воздуха создаются оптимальные условия питания и аэробного дыхания клетчаткоразрушающих бактерий. В этой зоне наиболее интенсивно идет процесс разрушения фильтровальной бумаги.
Через 8—10 суток на фильтре появляются желто-оранжевые пятна колоний клетчаткоразрушающих бактерий. Бумага фильтра ослизняется, разлагается, и фильтр постепенно оседает на дно. Из разрушенных масс клетчатки в колбе микробиологической петлей готовят мазок в капле жидкости. Мазок окрашивают фуксином или генцианвиолетом и микроскопируют, пользуясь объективом МИ-90. На препарате среди волокон клетчатки видны различные клетчаткоразрушающие бактерии, обрывки мицелия грибов, споры грибов (рис. 31).
Выделение клетчаткоразрушающих бактерий методом посева комочков почвы
|
|
Рис.31. Аэробные клетчаткоразрушающие бактерии. Среда Гетчинсона. Генциавиолет.Относительное количество аэробных клетчаткоразрушающих бактерий в почве определяют методом посева комочков почвы на пластинки агаризованной среды Гетчинсона. Среду Гетчинсона агаризуют. добавляя к ней 2% агар-агара, и стерилизуют 20 мин. В автоклаве при 1 атм. Из фильтровальной бумаги вырезают фильтры по размеру чашек Петри и тоже отправляют на стерилизацию. Соблюдая стерильность, разогретую среду Гетчинсона разливают в чашки Петри и на поверхность среды накладывают клетчатковый фильтр. Стеклянной палочкой с оттянутым концом высевают комочки почвы на поверхность фильтра, раскладывая их параллельными рядами на расстоянии 1 см (около 50 комочков на чашку). Засеянные чашки Петри помещают в эксикатор над водой и ставят его в термостат при температуре 25—30°С.
Через 10—14 суток и более, вокруг комочков почвы развиваются колонии клетчаткоразрушающих микроорганизмов в виде желтых, зеленых, оранжевых и коричневых пятен. В районах колоний бумага фильтра разлагается, ослизняется, становясь прозрачной. По характеру роста можно дифференцировать колонии плесневых грибов, актиномицетов и бактерий. Подсчитав число комочков почвы, давших колонии, определяют относительное количество клетчаткоразрушающих бактерий в почве, выражая его в процентах к общему числу высеянных комочков почвы.
Из зон разрушенной клетчатки готовят мазки в капле воды, помещенной на предметном стекле. Микроскопирование препаратов позволяет выделить различные виды клетчаткоразрушающих микроорганизмов. Примерная таблица записи результатов опыта:
| Вариант опыта | Повторность | Общее число высеянных комочков почвы | Число комочков почвы, давших колонии | Выделение клетчаткоразрушающих бактерий, % |
| Черноземная почва | 1 | 56 | 52 | 92,8 |
| 11 | 53 | 48 | 90,6 | |
| Серо-бурая почва | 1 | 54 | 21 | 38,8 |
| 11 | 57 | 24 | 42,1 |
Для определения аэробных клетчаткоразрушающих бактерий методом посева комочков почвы можно использовать и пластинки кремнекислого геля. Для пропитывания гелевых пластинок рекомендуется питательная среда Виноградского (2—3 мл среды на чашку Петри). Состав среды (г/л дистиллированной воды):
КNО3 —2,5
KH2РО4 —1,0
MgSO4 —0,5
|
|
|
NаСI —0,5
FeSO4 —0,01
Мn2(SO4)3 —0,01
Методика посева и обработка материала те же, что и при работе с агаризованной средой Гетчинсона.
VII
