Работа 28. Прямой счет микроорганизмов почвы под микроскопом

Метод прямого счета микроорганизмов С. Н. Виноградского и модификации О. Г. Шульгиной позволяет более точно учесть численность микроорганизмов в почве, нежели методы высева почвенной суспензии на агаризованные питательные среды. В свою очередь точный учет численности микроорганизмов в почве дает более полное представление о ее биогенности. Однако следует иметь в виду, что при работе данным методом получаются несколько завышенные результаты, так как на препаратах не удается дифференцировать живые и мертвые клетки микроорганизмов.

Материалы и оборудование

       Ступка, резиновая перчатка, спиртовка, часовое стекло, весы, разновесы, скальпель, пинцет, колба, содержащая 45 мл стерильной дистиллированной воды, исследуемая почва, микропипетки на 0,1—0,2 мл, обезжиренные предметные стекла, 5%-ный раствор карболового эритрозина, абсолютный спирт или 2%-ный раствор осмиевой кислоты, микроскоп.

 

Ход работы

       Небольшое количество исследуемой почвы растирают в течение 10 мин в ступке пальцем в резиновой перчатке. На часовом стекле отвешивают 5 г почвы и переносят ее в колбу, содержащую 45 мл стерильной воды, получают разведение 1/10. Если анализируемая почва характеризуется высокой численностью микроорганизмов, готовят следующее разведение. В колбу № 2, содержащую 90 мл стерильной воды, пипеткой приливают 10 мл почвенной суспензии из колбы № 1, получают разведение 1/100.

       Содержимое колбы встряхивают в течение 5 мин, затем дают крупным частицам отстояться 3—5 с и стерильной микропипеткой переносят 0,01—0,02 мл почвенной суспензии на обезжиренное предметное стекло, равномерно распределяя ее на площадь 4 см². Квадрат на стекле вычерчивают заранее алмазом, подложив под стекло миллиметровую бумагу.

       Приготовленный препарат высушивают на воздухе, фиксируют на пламени либо абсолютным спиртом 5 мин, либо парами 2%-ного раствора осмиевой кислоты 2—4 мин. Далее препарат окрашивают карболовым эритрозином 30—40 мин и более в зависимости от качества красителя. Эритрозин хорошо окрашивает бактериальные клетки и не окрашивает почвенные частицы. Окрашенный препарат промывают водой, высушивают и микроскопируют, пользуясь объективом МИ-90. Конденсор микроскопа тоже обязательно иммергируют.

       Подсчет микроорганизмов ведут в 50—100 полях зрения микроскопа либо в 50—100 квадратах окулярной сетки, если бактерий много. При подсчете отмечают соотношение морфологических форм бактерий.

       Расчет количества бактерий в 1 г почвы ведут по формуле:

 

Ax4x10⁸ xD

X=------------------------

50xBxC

где X — число бактерий в 1 г почвы, А — число бактерий в 50 полях зрения микроскопа, В — площадь поля зрения микроскопа, мкм², С— объем почвенной суспензии, мл, нанесенной на стекло, D — исходное разведение почвенной суспензии.

       Площадь поля зрения микроскопа определяют по формуле. Диаметр поля зрения микроскопа вычисляют с помощью окулярного и объективного микрометров. Определив цену деления окулярного микрометра при данном увеличении микроскопа, определяют диаметр поля зрения в микрометрах и рассчитывают площадь поля зрения микроскопа (см. выше).

       Пользуясь окулярным и объективным микрометрами, можно определить также площадь квадрата окулярной сетки.

Пример расчета

       Если сторона квадрата окулярной сетки равна 0,02 мм, а площадь квадрата—0,0004 мм² (окуляр 10Х, объектив 90Х),тогда на площадь препарата 4 см² приходится 1000 000 таких квадратов окулярной сетки. Допустим, что на один квадрат окулярной сетки в среднем приходится 3,5 бактерии, тогда на площади препарата 4 см² окажется: 3,5 х 1000000 = 3500000 бактериальных клеток. А если учесть, что на препарат наносили 0,01 мл почвенной суспензии, в которой содержится 0,001 г почвы (разведение 1/10), то полученную величину необходимо умножить на 1000, тогда в 1 г исследуемой почвы будет содержаться 3 500 ООО х 1000 = 3500000000 бактериальных клеток. Таким образом, каждая бактерия в квадрате окулярной сетки отвечает 1 млрд. бактерий в 1 г почвы.

 

ПРЕВРАЩЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ВЕЩЕСТВ

Работа 29. Аммонификация белка

Процесс разложения органических азотсодержащих веществ с выделением аммиака носит название аммонификации. Аммонификацию ведут различные микроорганизмы: бактерии, грибы, актиномицеты. Процесс идет в аэробных и анаэробных условиях.

Аммонификация белка начинается с гидролиза белка под влиянием протеолитических ферментов, выделяемых микроорганизмами, с образованием последовательно пептонов, полипептидов, дипептидов и аминокислот.

Далее аминокислоты путем дезаминирования разрушаются с образованием аммиака и разнообразных органических соединений в соответствии с характером аминокислот и окружающих условий среды. Продукты промежуточного распада аминокислот могут быть ассимилированы клетками микроорганизмов или разрушены ими дальше. Основными конечными продуктами аэробной минерализации белка являются аммиак, углекислый газ, вода, соли серной и фосфорной кислот.

В анаэробных условиях промежуточные продукты распада аминокислот полностью не минерализуются. Поэтому при разрушении белка в анаэробных условиях, помимо аммиака и углекислого газа, накапливаются различные органические соединения: органические кислоты, спирты; сероводород и его производные—меркаптаны; токсические соединения—диамины и птомаины (в частности, кадаверин, компонент трупного яда); дурно пахнущие продукты — индол и скатол. Материалы и оборудование

Весы, разновесы, колба объемом 100—150 мл, стерильная дистиллированная вода, почва, водяная баня, электроплитка, спиртовка, микробиологическая петля, пинцет, скальпель, предметные стекла, целлофан, резиновые колечки, чашки Петри, красная лакмусовая бумага, полоски фильтровальной бумаги, пропитанные 10%-ным раствором ацетата свинца, водный раствор фуксина или генцианвиолета, микроскоп, пробирки с МПБ, МПА и средой Мишустина.

Ход работы

Получение накопительной культуры аммонификаторов-аэробов

Аммонификаторы-аэробы обычно выделяются на пластинках МПА в чашках Петри. Однако следует иметь в виду, что на МПА, помимо аммонифицирующих бактерий, могут выделяться и другие микроорганизмы.

Для заражения питательной среды в колбе объемом 250 мл готовят почвенную суспензию: 10 г почвы на 90 мл стерильной дистиллированной воды. Пробирки с МПА разогревают на водяной бане, охлаждают до температуры 40—50°С и заражают почвенной болтушкой, перенося одну петлю взвеси из колбы в пробирку с МПА. Содержимое пробирки перемешивают вращением ее между ладонями и выливают в стерильную чашку Петри. Засеянные чашки Петри помещают в термостат при температуре 25— 28°С.

Через 3—4 суток на поверхности МПА в чашках Петри развиваются колонии микроорганизмов. Наиболее характерные из развившихся колоний описывают и микроскопируют. На пластинках МПА преимущественно развиваются колонии бацилл.

Вас.subtilis— подвижная палочка, одиночная или соединенная в длинные цепочки, размером 3—5 мкм. Споры овальные, располагаются центрально. Колонии на МПА, сухие, морщинистые, срастающиеся с агаром.

Вас. subtilis vаr теsепtеriсиs— подвижная палочка размером 3—10 мкм, часто соединенная в цепочки. Споры овальные, расположены центрально. Колонии на МПА тонкие, сухие, морщинистые, не срастаются с субстратом.

Вас. сеrеиs— подвижная толстая палочка, нередко соединенная в цепочки, размером 3—5 мкм. Споры овальные, расположены центрально. Колонии на МПА, толстые, со складчатым центром и ризоидными волнистыми краями.

Вас. сеrеиs vаr тусоidеs— подвижная палочка, одиночная или соединенная в цепочки, размером 5—10 мкм. Споры овальные, расположены центрально. Колонии на МПА, плоские ризоидные, стелющиеся по поверхности агара.

Помимо бацилл, на пластинках МПА развиваются колонии бактерий, преимущественно Рseudomonas fluorescens— мелкая, подвижная палочка размером 1—2 мкм. Культура образует зеленовато-желтый флуоресцирующий пигмент. На МПА колонии часто бесцветные, выпуклые, блестящие; Proteus vulgaris— клетки отличаются большой полиморфностью, в молодых культурах клетки мелкие, размером 1—3 мкм, подвижные, позднее появляются нитевидные формы длиной 10—20 мкм. Колонии стелются по поверхности агара тонким, едва заметным налетом, Achromobacter prodigiosum— мелкая, подвижная палочка, близкая по форме к кокку, размером 0,6—1,0 мкм. Колонии на МПА гладкие или зернистые, ярко-красные, с металлическим блеском.

Для выделения исключительно спорообразующих аммонифи-цирующих бактерий почвенную болтушку предварительно перед высевом пастеризуют на водяной бане 10 мин при температуре 80°С. При этом вегетативные клетки бактерий погибают, споры сохраняются жизнеспособными. Высев из почвенной болтушки проводят на среду Мишустина (смесь МПА с СА в отношении 1:1) в чашки Петри, как указано выше, для выделения аммонификаторов-аэробов.

На среде Мишустина по культуральным и частично по морфологическим признакам удается дифференцировать ряд бацилл на виды. При проведении микробиологического анализа почвы изучению споровых форм бактерий уделяется особое внимание, так как каждый тип почвы характеризуется своей специфичной бациллярной микрофлорой. Спорообразующим формам бактерий отводится ведущая роль в превращении сложных органических веществ в почве, не разлагающихся под воздействием неспороносных бактерий. Количество споровых форм бактерий в почве является, по Мишустину, показателем глубины трансформации органических веществ, а следовательно, и плодородия почвы.

Получение накопительной культуры аммонификаторов-анаэробов.

Аммонификаторы-анаэробы легко выделяются на мясном бульоне с добавлением 2%-ного пептона, оптимальная рН среды 7—8. Среду наливают высоким слоем в большие пробирки, закрывают плотно ватными пробками и стерилизуют в автоклаве.

 

Рис. 19. Аммонификаторы белка анаэробы: Clostridium paraputrificum и Clostridium bifermentas. Фуксин.

Рис. 19. Аммонификаторы белка анаэробы: Clostridium paraputrificum и Clostridium bifermentas. Фуксин.

 

Через 3—5 суток определяют продукты аммонификации белка. Выделение аммиака обнаруживается посинением красной лакмусовой бумаги, выделение сероводорода — почернением бумаги, смоченной уксуснокислым свинцом. Из нижних слоев жидкости готовят накопительный мазок, окрашивают его фуксином или генцианвиолетом и микроскопируют.

Среду заражают комочком почвы. Для обнаружения выделяющегося аммиака под пробку пробирки подвешивают полоску красной лакмусовой бумаги, а для обнаружения сероводорода — полоску фильтровальной бумаги, смоченную 10 %-ным раствором уксуснокислого свинца. Полоски бумаги не должны касаться жидкости в пробирке. Для герметичности пробирку плотно закрывают целлофановым колпачком, закрепляя его резиновым колечком. Зараженные пробирки помещают в термостат при температуре 25—28°С.

На препаратах преимущественно выделяются бактерии: Clostridium paraputrificum —подвижная, палочка, одиночная или соединенная в цепочки, размером 7 — 9 мкм. Спора расположено терминально на одном из концов клетки. Встречается в гниющих трупах, навозе, пищевых, продуктах; Clostridium bifermentas — подвижная палочка, одиночная или соединенная в цепочку, размером 3—5 мкм. Спора расположена эксцентрально. При разложении белка образуется большое количество сероводорода (рис. 19).