Тема 8 Клонирование животных

 

План лекции

1. Репродуктивное клонирование.

2. Метод клонирования с помощью пересадки ядер.

3. Терапевтическое клонирование.

Клонирование в биологии – это получение точных копий организма или другого объекта, например, клетки или гена. Клонирование – один из методов биотехнологии животных для создания моделей изучения раковых заболеваний человека.

Репродуктивное клонирование животных, которое стало возможным благодаря успехам клеточных технологий и генной инженерии, привлекает наибольшее внимание ученых и общественности. Для репродуктивного клонирования используется метод переноса клеточного ядра соматической клетки (ПЯСК) в яйцеклетку с удаленным ядром. Стимуляция ее деления и внедрение в матку суррогатной матери может привести к рождению практически идентичной копии донора ядра (небольшую часть наследственной информации – гены митохондриальных хромосом – клон получит из цитоплазмы яйцеклетки). К сожалению, из-за сложности методики один здоровый клон любого из видов млекопитающих получается в лучшем случае из 200-300 обработанных таким образом яйцеклеток. Тем не менее, за время, прошедшее с рождения знаменитой овечки Долли, успешно клонированы десятки видов домашних и диких животных. Кроме научных целей, репродуктивное клонирование может применяться для восстановления исчезнувших или сохранения редких видов, выведения новых пород животных и т.д. Репродуктивное клонирование приматов пока не увенчалось успехом, а клонирование человека, хотя теоретически и возможно, по этическим соображениям в большинстве стран законодательно запрещено.

Микроманипулирование с дробящимися эмбрионами домашних животных представляет двусторонний интерес: подтверждение или установление основных механизмов развития и дифференциации зародышей и использование для практических полей потенциальных возможностей развития и регуляторной способности эмбрионов.

Возможность микроманипулирования с отдельными эмбрионами была продемонстрирована около 50 лет назад.

Pincus (1936) вводил одиночные бластомеры из 2-клеточного эмбриона кролика в яйцевод ложнобеременной крольчихи, в результате эмбрионы нормально развивались с дифференциа­цией их клеток до стадии бластоцисты, но уменьшенного размера. Затем было получено потомство у кроликов и мышей из 2-клеточных эмбрионов с разрушением одного бластомера путем прокола его иглой.

В последние 20 лет проведено много микрохирургических операций на эмбрионах мышей: удаление зоны пеллюцида, разделение бластомеров, агрегация с удаленной зоной пеллюцида эмбрионов и бластомеров, инъекция одиночных или агрегатированных клеток в полость ранней бластоцисты и т.д. Однако отсутствие удовлетворительных методов культивирования микроманипулированных эмбрионов in vitro в сочетании с неспособ­ностью эмбриональных клеток выживать in vivo после разрыва или удаления зоны пеллюцида до недавнего времени тормозили использование микрохирургической техники для детального анализа эмбрионального развития млекопитающих.

Функция зоны пеллюцида в период раннего развития эмбриона, по-видимому, определяется необходимостью предотвратить рассыпание бластомеров, прямой контакт с другими эмбрионами и чужеродными клетками, лейкоцитами, сперматозоидами и облегчить прохождение эмбриона через яйцевод. За исключением некоторых видов животных, в частности кролика, зона пеллюцида несущественна для продолжения нормального развития in vivo после того, как полностью закончится компактизация морулы. Для нормального развития эмбрионов более раннего возраста in vivo зона пеллюцида должна не только присутствовать, но и быть относительно интактной.

Решение этой задачи было найдено путем использования агара для защиты in vivo эмбрионов с нарушенной зоной пеллюцида (Willadsen, 1979). Заключение в агар, который практически нерастворим в половом тракте самки и закупоривает любые отверстия в зоне пеллюцида, позволяет эмбриональным клеткам выживать и развиваться in vivo. Техника заключения эмбрионов с нарушенной зоной пеллюцида в агар следующая. Зону пеллюцида удаляют и бластомеры отделяют в группы клеток или разделяют. Выделенные бластомеры инъецируют в пустую зону пеллюцида. После заполнения периветеллинового пространства сывороткой крови овцы эмбрион вводят в небольшой цилиндр агара, который помешают в более крупный. Последний вводят в лигатированный яйцевод овцы до образовании ранней бластоцисты. Затем цилиндр агара извлекают, эмбрион освобождают от него и пересаживают реципиенту.

При заключении эмбриона в агар он должен быть полностью покрыт им, так чтобы свободно перемещались клетки внутри эмбриона в период развития и взаимодействия их между собой. Цилиндр агара должен быть небольшим по объему, чтобы его можно было легко ввести в яйцевод, и устойчивым к разрушению.

Для культивирования заключенных в агар эмбрионов в качестве временных реципиентов использовали кроликов в фолликулярной фазе цикла. Однако выживаемость интактных эмбрионов овец, коров и особенно свиней значительно уменьшается, если период культивирования эмбрионов этих животных в яйцеводе кролика более 3 дней. Поэтому в качестве временных реципиентов стали испытывать овец. Наблюдения показали, что в лигатированном яйцеводе овцы создаются благоприятные условия и для развития эмбрионов коровы и свиньи вплоть до вылупившейся бластоцисты. Поэтому лигатированный яйцевод овцы был исполь­зован как стандартная схема для культивирования микромани­пулироваиных эмбрионов всех видов домашних животных. В первых опытах использовали овец в качестве временных реципиентов только с синхронизированной охотой с донором. Однако впоследствии было показано, что яйцевод анэстральной овцы вполне удовлетворяет этой цели. Эта техника была широко использована для получения однояйцовых близнецов и химерных животных у всех основных видов домашних животных.

Не менее заманчивы перспективы использования техники получения химер для конструирования животных, устойчивых к определенным заболеваниям и с желательными хозяйственными признаками.

Все клетки организма животных несут одинаковую генетическую информацию. Однако в процессе морфогенеза соматические клетки дифференцируются, в результате чего часть генома репрессируется. Чем выше уровень специализации клеток, тем меньше их тотипотентность. Эта закономерность была установлена в экспериментах по пересадке ядер.

Пересадка ядер эмбриональных клеток в энуклеированные половые клетки открывает широкие возможности многократного увеличения числа идентичных потомков или клонов. Реализация этого приема особенно возросла в связи с разработкой нехирургического метода извлечения эмбрионов у коров. Получение от высокоценной коровы-донора пяти 32-клеточных эмбрионов и пересадка каждого ядра (бластомера) в энуклеированную яйцеклетку позволяет получать от донора одновременно 160 эмбрионов. При повторной пересадке ядер из полученных «вторичных» эмбрионов открываются возможности получения неограниченного числа потомков от выдающихся самок.

В 1952 г. Бриггс и Кинг впервые осуществили пересадку ядер клеток на амфибиях и показали, что ядра из ранних эмбриональных клеток сохраняют способность к дальнейшему развитию после пересадки их в энуклеированные яйцеклетки. Они также установили, что ядра из эмбрионов на более поздней стадии развития не дробились, если пересаживались в энуклеированную яйцеклетку, так же как и ядра из менее развитых эмбрионов. Это обусловлено дифференциацией эмбриональных клеток, которая проявляется на стадии перестройки мидбластулы. Это та стадия, при которой эмбрионы начинают продуцировать свою собственную РНК, до этого времени они реализовали материнскую транскрипцию (Newport и Korschner, 1982 а, б).

Illmense и Норре (1981) сообщили о первой успешной пересадке ядер млекопитающих и получении потомства на мышах.

Эффективная пересадка ядер на сельскохозяйственных животных впервые была проведена Willadspn (1986). Он применял следующую технологию пересадки. Неоплодотворенные яйцеклетки извлекал у овец через 30—33 ч после обработки их ХГ в начале охоты. Тонкой стеклянной иглой он делал разрез зоны пеллюцида над полярным тельцем неоплодотворенной яйцеклетки и помещал ее в фосфатную среду с цитохалазином Б (5 мкг/мл). Через 1 ч после начала культивирования отсасывал пипеткой полярное тельце и окружающую его цитоплазму. Таким образом, удавалось разделить примерно 90 % яйцеклеток на 2 части с интактными клеточными мембранами, каждая из которых содержала примерно половину цитоплазмы. Цитологический анализ этих половинок ооцитов показал, что 75 % тех половинок, которые были удалены с полярным тельцем, содержали хромосомы на стадии метафазы II («ядерные» половинки яйцеклеток), тогда как другие половинки из тех же ооцитов не содержали ядерных структур («энуклеированные» половинки яйцеклеток). Одиночные бластомеры из 8- или 16-клеточных эмбрионов вводили под зону пеллюцида, содержащую энуклеированную или ядерную половинку яйцеклетки. Слияние ядра с цитоплазмой клетки проводили с помощью вируса Синдая или электрослиянием. В первом случае слияние наступало в 50 % случаев в течение 4 ч, а во втором — в 90 % случаев в пределах I ч.

Те эмбрионы, в которых произошло электрослияние, были помещены в фосфатный буфер при комнатной температуре. Затем их заключали в агар и пересаживали в лигатированные яйцеводы овец (Willadsen, I979). Через 4,5 5,5 дней эмбрионы извлекали и оценивали их развитие. Из числа эмбрионов, полученных после пересадки пронуклеусов в энуклеированные яйцеклетки, стадии бластоцисты достигали 33,3 % при слиянии вирусом Синдая и 42,1 —48,3 % при электрослиянии, а после пересадки в «ядерные» яйцеклетки и применении электрослияния только 5,3- 11,4%. В этом эксперименте пересадка 3 из 4 бластоцист сопровождалась рождением потомства. Все 3 ягненка были получены из эмбрионов, в которых бластомер из 8-клеточного эмбриона был пересажен в энуклеированную половинку неоплодотворенной яйцеклетки. В другом эксперименте было получено несколько беременностей от пересадки эмбрионов- из энуклеированных яйцеклеток с введен­ными в них бластомерами из 16-клеточных эмбрионов. Таким образом, можно заключить, что бластомеры в 16-клеточном эмбрионе овцы остаются тотипотентными.

В опытах Prather el al. (1987) бластомеры из двух 32-клеточных эмбрионов коров пересаживали в энуклеированные ооцисты после созревания in vivo или in vitro путем электрослияния. Когда пересаживали бластомеры из эмбрионов на более поздних стадиях (16—32-кдеточные против 2 8-клеточных), то эффективность электрослияния была ниже (р< 0,01). Эмбрионы, культивируемые после слияния in vitro, развивались до 4—б-клеточной стадии, тогда как культивируемые in vivo (в лигатированном яйцеводе овцы) развивались до стадии морулы или бластоцисты после 4 или 5 дней. Ооциты, извлеченные через 36 ч после начала охоты и используемые в качестве реципиентов ядер эмбриональных клеток, чаще достигали стадии морулы или бластоцисты, чем ооциты, созревшие in vitro или извлеченные через 48 ч после начала охоты (20 % против 7,8 % и 6,7 % соответственно; р <0,02). Получено 7 беременностей после нехирургической пересадки 19 таких эмбрионов 13 телкам на 6—8-й день после охоты. У 2 телок родились живые телята.

Таким образом, в опытах на овцах и крупном рогатом скоте показано, что ядра из дробящихся эмбрионов на ранних стадиях развития могут быть репрограммированы к развитию подобно пронуклеусу эмбриона на стадии зиготы. Результаты этих экспериментов дают основание предполагать, что с повышением эффективности техники пересадки ядер эмбриональных клеток в энуклеированные яйцеклетки можно получать множественные копии из единичного эмбриона.

Терапевтическое клонирование – перспективный метод, позволяющий получить стволовые клетки со свойствами эмбриональных, но генетически идентичные донору ядра. Это идеальный материал для клеточной терапии, тканевой инженерии и, в недалеком будущем – для выращивания сложных «запасных» органов. В течение нескольких лет усилия ученых во всём мире концентрировались в основном на попытках разработки методики терапевтического клонирования, аналогичной репродуктивному. При этом эмбрион в возрасте не старше 14 дней, состоящий из нескольких сотен клеток, разрушается, и эмбриональные стволовые клетки далее развиваются в клеточной культуре. Совсем недавно сразу две группы ученых, в Японии и США, сумели методами генной инженерии перепрограммировать взрослые клетки кожи – фибробласты – в клетки, практически не отличающиеся от эмбриональных по способности превращаться в любые типы клеток человеческого организма. Даже Ян Уилмут, создатель Долли, объявил, что отказывается от попыток терапевтического клонирования методом переноса клеточного ядра и переходит на эту новую технологию.

Трансгенные животные, продуцирую назначения. Основа стратегии использования трансгенных животных как биореакторов состоит во включении в клетки организма генов, которые вызывают у них синтез новых белков, как правило, медицинского и технологического назначения.

Раньше такие белки были выделены из тканей и биологической жидкости тканей человека, таких, как кровь (фактор свертываемости крови и другие белки крови) и гипофиз (гормон роста). Вследствие дороговизны и трудности получения человеческих тканей, эти белки могут производиться в малых количествах и к тому же являются объектом контаминации патогенных организмов, таких как вирус гепатита и др.

На первом этапе практического применения молекулярной генетики было создание рекомбинантных микроорганизмов, а позднее трансгенных клеточных линий млекопитающих, которые выращиваются в системах биореакторов и способны производить белки, закодированные экзогенными (чужеродными) генами. Эти системы были успешно использованы в получении ценных продуктов фармакологического и медицинского назначения, такие, как инсулин, некоторые кровесвертывающие факторы, человеческий гормон роста и др.

Трансгенные животные, как продуценты ценных биологиче­ски активных белков, имеют ряд преимуществ перед микроор­ганизмами и клеточными системами.

Белки млекопитающих, продуцируемые микроорганизмами не могут быть нормально гликолизированы, β-гидроксилированы или карбоксилированы. В простых рекомбинантных системах микроорганизмов это в большинстве случаев или невозможно, или возможно, но с недостаточной точностью, что приводит к изменению структуры протеинов и, как следствие, к снижению их биологической активности.

Получаемые новые белки в линиях генноинженерных клеток млекопитающих могут быть в некоторых случаях правильно модифицированы, с активностью, сравнимой с нативными протеинами, но выход белка из культуральных клеток в основном низкий. К тому же создание клеточных культур является сложной и дорогой процедурой. Промышленные реакторы, в которых клетки выращиваются, также являются дорогими, как в отношении их стоимости, так и в отношении их обслуживания. Трансгенные животные могут быть трудно создаваемыми и дорогими, но однажды созданная линия таких животных воспроизводит себе подобных, они легко размножаются и их содержание сравнительно дешево и, в принципе, могут продуцировать чрезвычайно большое количество белков с низкой стоимостью.

Гетерогенные белки могут быть получены большинством тканей тела животного. Путем сочетания структурных генов со специфическими регуляторными элементами можно добиться экспрессии трансгенов в определенных органах.

Наибольший прогресс в производстве трансгенных биореакторов был достигнут в целенаправленной трансгенной экспрессии в эпителиальные клетки молочной железы и производстве белков с молоком. Структурный ген, связанный с промотором гена молочного протеина, в первую очередь будет экспрессироваться в клетках молочной железы.

Одним из основных этапов в получении трансгенных живот­ных, продуцирующих гетерогенный белок с молоком, является идентификация промотора, который будет направлять экспрессию в секреторный эпителий молочной железы. В настоящее время выделены гены и промоторы aSl-казеина, (3-казеина, a-лактоальбумина, [3-лактоглобулина и сывороточного клелого протеина (WAP).

Использование молочной железы как места производства чужеродных протеинов обосновывается огромной синтетической белковой продуктивностью молочной железы. Общая концентрация эндогенных молочных белков в зависимости от вида на­ходится в пределах 2—10%, т. е. на уровне 20—100 граммов на литр. Если еще нет возможности получать такое же количество рекомбинантного белка из 1 л молока, то выделение одного и более граммов такого белка уже достаточно для коммерческого производства фармацевтически важных белков.

Среди рекомбинантных белков, полученных из молока трансгенных животных, известны следующие: человеческий белок С, антигемофильный фактор IX, альфа-1-антитрипсин, тканевый плазменный активатор, лактоферин, человеческий сыво­роточный альбумин, интерлейкин-2, урокиназа и химозин. За исключением альфа-Ьантитрипсина и химозина работы по по­лучению большинства других белков не достигли стадии, которая бы представляла коммерческий интерес. В большинстве проектов эта работа на стадии экспериментов, когда генная конструкция оценивается лишь на трансгенных мышах.

Что же касается человеческого альфа-1-антитрипсина и химозина, то получение этих рекомбинантных протеинов уже находится на стадии, близкой к коммерческой.

Группа ученых в Эдинбурге (Великобритания) в 1992 г. получила трансгенных овец с человеческим геном альфа-1-анти-трипсина и бета-глобулиновым промотором. У четырех овец содержание этого белка составляет более 1 г/л, а одна овца сначала продуцировала 60 г/л, а затем стабилизовалась на 35 г/л, что соответствует половине всех белков в молоке. Все овцы здо­ровы и не имеют каких-либо нарушений лактации. При таком уровне продукции белка может быть получено более 10 кг бел­ка от одного животного в год, что достаточно для 50 пациентов при лечении эмфиземы легких.

Группа ученых в Москве (Л.К. Эрнст, Г. Брем, М.И. Прокофьев, И.Л. Гольдман и др.) получила трансгенных овец с ге­ном химозина, которые продуцируют с молоком в среднем 200—300 мг фермента химозина в 1 л молока. Этот новый ис­точник получения химозина — основного компонента для произ­водства сыра — может заменить традиционный способ его получения из сычугов молочных телят и ягнят, так как его стоимость будет в 5—10 раз ниже. Из трех литров молока трансгенной овцы можно получить такое количество химозина, которое достаточно для производства одной тонны сыра из коровьего молока.

Из сказанного можно заключить, что многие белки, используемые при лечении человека и для технологических целей, могут быть получены с помощью трансгенных животных, продуцирующих их с молоком.